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Tobias Alexander Weber

• The transcription factor p63 is part of the p53 protein family, which consists of three members, p53, p63 and p73. P63 shares structural similarity with all family members, but is associated to different biological functions than p53 or p73. While p53 is mainly linked to tumor suppression and p73 is connected with neuronal development, p63 has been connected to critical biological roles within ectodermal development and skin stem cell biology as well as supervision of the genetic stability of oocytes. Due to its gene structure p63 is expressed as at least six different isoforms, three of them containing a N-terminal transactivation domain. The isoforms that are of biological relevance both have a C-terminal inhibitory domain that negatively regulates the transcriptional activity. This inhibitory domain is supposed to contain two individual components of which one is internally binding and masking the transactivation domain while the other one can be sumoylated. To further investigate this domain a mutational analysis with the help of transactivation assays in SAOS2 cells was carried out to identify the critical amino acids within the inhibitory domain and the impact on transcriptional activity of TAp63alpha, the p63-isoform which is essential for the integrity of the female germline. The results of these experiments show that a stretch of approximately 13 amino acids seems to be important for the regulation of transcriptional activity in TAp63alpha, due to the increased transcriptional activity occurring in this region after mutation. Additional experiments showed that this mechanism is distinct from sumoylation, which seems to have only implications for the intracellular level of TAp63alpha. As a conclusion, the C-terminus of the Tap63alpha is essential for two different mechanisms, which control the transcriptional activity of the protein. Both regulatory elements are independent from each other and can now be restricted to certain amino acids. Activation of the wild type protein might take place in the identified region via post-translational modification. Furthermore an inhibition assay was carried out to test if the same region might have implications on the second biological relevant isoform deltaNp63alpha. The results show that the same amino acids which show an impact on transcriptional activity in Tap63alpha lead to a significant change in functional behaviour of deltaNp63alpha. There is a possibility that both proteins are regulated with opposite effects via the same mechanisms, based at the C-terminus of the p63alpha-isoforms. In both cases a modification of these residues could lead to a more opened conformation of the protein with consequences on promoter binding, which can be even important for deltaNp63alpha with respect to promoter squelching. Both alpha-isoforms seem to be regulated via the C-terminus and to elucidate if that is also the case for TAp63gamma a deletion analysis was carried out. The results show that there are also amino acids within the C-terminus of TAp63gamma, which have implications on the transcriptional activity of the protein. Therefore the C-terminus seems to play a major role for regulation of diverse p63 isoforms.
• Der Transkriptionsfaktor p63 ist Mitglied der p53-Familie. Zu dieser zählen auch die Transkriptionsfaktoren p53 und p73, wobei diese Proteine trotz struktureller Homologien in unterschiedlichen biologischen Vorgängen innerhalb der Zelle involviert sind. Während p53 als Tumorsuppressor agiert, wird p73 hauptsächlich mit der neuronalen Entwicklung in Verbindung gebracht. P63 spielt wiederum eine kritische Rolle in der Entwicklung des Epithelgewebes als auch der Aufrechterhaltung der genetischen Integrität in Oocyten. P63 kann aufgrund der Genstruktur in sechs verschiedenen Isoformen in der Zelle vorliegen. Von den möglichen Isoformen sind zwei in den genannten biologischen Vorgängen involviert. Drei der sechs möglichen Isoformen verfügen über eine N-terminale Transaktivierungsdomäne (TA-Isoformen), die deltaN-Isoformen dagegen nicht. Die längste Isoform TAp63alpha besteht aus insgesamt sechs Domänen, Transaktivierungsdomäne (TA), DNA-Binde-Domäne (DBD), Oligomerisierungs-domäne (OD), SAM- (Sterile alpha motif) Domäne, QP- (Glutamine and Proline rich region) Domäne und die Transaktivierungs-inhibierende Domäne (TID). Des Weiteren gibt es am C-terminus von TAp63alpha noch eine Sumoylierungssequenz. Die beta- und gamma- Isoformen von p63 unterscheiden sich in ihrem C-terminus und von ihrem Molekulargewicht von den alpha-Isoformen. Daher verfügen nur die beiden biologisch relevanten alpha-Isoformen C-terminal über die TI-Domäne, welche Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität über die Bindung der TA-Domäne hat. Ebenso beeinflusst die Sumoylierung am C-terminus die transkriptionelle Aktivität. Um den Zusammenhang zwischen beiden Mechanismen zu untersuchen, sowie die für die Inhibition wichtigen Aminosäuren zu identifizieren wurde in dieser Doktorarbeit eine Mutationsstudie von TAp63alpha mit Hilfe von Transaktivierungsassays in SAOS2 Zellen durchgeführt. Das Ergebnis dieser Experimente führte zu der Identifizierung einer Folge von etwa 13 Aminosäuren, welche Auswirkungen auf die transkriptionelle Aktivität des Proteins haben. Diese Auswirkungen auf die intrinsische Aktivität von TAp63alpha unterscheiden sich auch von den Effekten der Sumoylierung, da gezeigt werden konnte dass sich die transkriptionelle Aktivität in diesem Fall nur indirekt über die Steuerung der intrazellulären Proteinkonzentration ändert. Es lässt sich daher schlussfolgern, dass der C-terminus von TAp63alpha essentiell für zwei unterschiedliche und unabhängige Vorgänge ist, welche Auswirkungen auf die transkriptionelle Aktivität von TAp63alpha haben. Beide Vorgänge lassen sich nun auf bestimmte Aminosäuren beschränken. Um festzustellen, ob dieselben Aminosäuren, welche Auswirkungen auf die transkriptionelle Aktivität von TAp63alpha haben ebenso die zweite biologisch relevante Isoform deltaNp63alpha beeinflussen, wurden Inhibierungsassays durchgeführt. Die analogen Aminosäuren haben in diesem Fall massive Auswirkungen auf die direkten inhibitorischen Fähigkeiten von deltaNp63alpha. Es ist denkbar, dass beide Isoformen über denselben Mechanismus reguliert werden, mit jeweils unterschiedlichen Auswirkungen. In beiden Fällen könnte eine Modifikation dieser Aminosäuren zu einer offeneren Konformation führen, was zu erhöhter Promoter-Affinität führen könnte. Dies hätte auch Auswirkungen auf deltaNp63alpha im Sinne von Promoter Squelching. Zusammenfassend werden beide alpha-Isoformen über den C-terminus reguliert. Ob dies analog auch für TAp63gamma mit einem zu den alpha-Isoformen unterschiedlichen C-terminus gilt, wurde anhand einer Deletionsstudie überprüft. Hierbei führte die Deletion bestimmter Aminosäuren auch zu einer signifikanten Änderung der transkriptionellen Aktivität. Anhand der durchgeführten Experimente lässt sich daher schlussfolgern, dass bestimmte Elemente im C-terminus der untersuchten p63-Isoformen sehr wichtig für die Regulation dieser p63-Isoformen Ist.