Funktionelle Analyse der Helper-Component Proteinase (HC-Pro) aus Zucchini Yellow Mosaic Virus

Functional analysis of the helper-component proteinase (HC-Pro) of zucchini yellow mosaic virus

  • In dieser Arbeit wurde der Einfluss einer Punktmutation der ZYMV HC-ProFINK auf die RNA Silencing Suppressor-Aktivität und die miRNA-Akkumulation in N. benthamiana-Pflanzen untersucht. Dabei konnte eine RNA Silencing Suppressor-Aktivität der HC-ProFINK nachgewiesen werden. Sowohl die HC-ProFRNK als auch die HC-ProFINK zeigten in vivo keinen Einfluss auf die Änderung der miRNA-Mengen in N. benthamiana-Pflanzen. Untersuchungen der in vitro sRNA-Bindung mit rekombinanten HC-Pro-Proteinen aus Pflanzen führte zu einer Bindung von 21 bp siRNAs und miRNAs durch die HC-ProFRNK, wobei kein Einfluss zwischen der Anzahl und Lage der Basenfehlpaarungen der miRNAs und der Bindungskapazität identifiziert werden konnte. Diese Bindung ist vermutlich abhängig von der Sequenz der miRNAs. Die Mutation von HC-ProFRNK zu HC-ProFINK bewirkte dagegen den Verlust der Bindung von kleinen RNA-Molekülen. Die HC-Pro Proteine konnten rekombinant mit einem N-terminalen Fusionsprotein exprimiert und gereinigt werden. Die funktionelle Analyse des MBP-HA-HC-ProFRNK-Proteins wies eine längenspezifische Bindung von 21 bp siRNAs auf. Die Analyse der in vitro Bindung von unterschiedlichen miRNAs aus A. thaliana und Mensch durch das rekombinante HC-ProFRNK-Protein aus Bakterien zeigte keinen Zusammenhang zwischen der Anzahl und Lage der Basenfehlpaarungen in den miRNAs und der Bindekapazität. Die Mutation im MBP-HA-HC-ProFINK-Protein führte zum Verlust der sRNA-Bindung. Diese Ergebnisse bestätigten die Beobachtungen der Gelshift-Analysen mit den rekombinanten HC-Pro-Proteinen aus Pflanzen. Durch die Fraktionierung eines A. thaliana-Proteinextrakts konnte ein nicht näher beschriebenes Protein unbekannter Funktion, welches eine Cupin-Domäne (QP) besitzt, identifiziert werden. Dies hat einen Einfluss auf die in vitro Bindung von sRNA-Molekülen durch die HC-Pro. Eine funktionelle Analyse des Trx-QP-His-Proteins mit Hilfe von Gelshift-Analysen nach der Expression in Bakterien und Reinigung zeigte einen konzentrationsabhängigen verstärkenden Effekt der siRNA Bindung durch das rekombinante MBP-HA-HC-Pro-Protein. Die Zugabe eines fraktionierten N. benthamiana-Proteinextrakts zur in vitro Bindungsreaktion führte ebenfalls zu einer verstärkten siRNA-Bindung durch die HC-Pro; Proteinextrakte von N. tabacum und der ZYMV Wirtspflanze Zucchini zeigten jedoch keinen Effekt. Die ZYMV HC-Pro besitzt eine von der TEV HC-Pro abweichende proteolytisch aktive Domäne. Durch eine rekombinante Expression des MBP-HA-HC-Pro-GFP-Fusionsproteins in Bakterien und Deletionsanalysen konnten zwei kritische Aminosäuren im C-terminalen Bereich der HC-Pro identifiziert werden. Eine Deletion der AS Asn-353 oder Glu-356 führte zum vollständigen Verlust der autoproteolytischen Aktivität des Proteins. Ein Austausch der AS Gly-456 innerhalb der Schnittstelle sowie eine N-terminale Deletion von 93 AS der HC-Pro hatten dagegen keinen Einfluss auf die autoproteolytische Aktivität. Mit Hilfe einer N-terminalen Sequenzierung des C-terminalen Spaltproduktes des MBP HC Pro mut C7-GFP, welches vermutlich in Folge einer Spaltung durch bakterielle Proteasen entsteht, sollten durch Deletionsmutanten die kritischen Aminosäuren für die Spaltung untersucht werden. Eine Deletion der konservierten AS Thr-146 von ZYMV HC-Pro sowie der flankierenden AS Val-145 bzw. Gln-147 hatte jedoch keinen Einfluss auf die Spaltung der HC-Pro. Dies deutet darauf hin, dass die Schnittstelle der Protease von deren Erkennungssequenz abweicht. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass die ZYMV HC-Pro neben der sRNA-Bindung einen weiteren Mechanismus besitzt, um die Funktion als RSS auszuüben. Weitere Analysen sind nötig, um die Interaktion mit pflanzlichen Komponenten zu identifizieren und den Einfluss auf den RNA Silencing-Mechanismus aufzuklären.
  • An amino acid change in the highly conserved FRNK-box of the ZYMV HC-Pro, where the arginine at position 180 was replaced by isoleucine, caused attenuation of the symptoms after virus infection of the host plants. To further characterize the effect of the point mutation on the RNA silencing suppressor activity, the HC-ProFINK protein was transiently expressed in N. benthamiana 16c plants using the Agrobacterium-mediated infiltration method, whereas the silencing suppressor construct was co-infiltrated with a GFP inverted repeat construct to induce silencing. It was demonstrated that the mutant shows silencing suppressor activity, comparable to the HC-Pro wild type. In vivo studies analyzing the change of miRNA levels in infiltrated N. benthamiana plants, where either the HC-ProFRNK or the HC-ProFINK proteins were transiently expressed showed no significant changes in the miRNA levels compared to the control plants. To gain insight into the binding activities of small RNAs, recombinant HC-Pro proteins from plants were used for in vitro binding studies using artificial siRNA and miRNA duplexes. A strong binding of 21 bp siRNAs could be observed for HC-ProFRNK, although different miRNA heteroduplex structures from plants and human were analyzed for the influence of structure and length on binding capacity. This analysis showed a clear difference in the binding behaviour of the tested miRNAs by HC-Pro, but no correlation between the amount and position of the mismatches and the binding strength. Surprisingly, the mutant HC-ProFINK completely lost the ability to bind small RNA molecules in vitro, indicating the importance of the FRNK-box in RNA binding. To obtain a high amount of purified and functional ZYMV HC-Pro protein, it was expressed as a recombinant protein in E. coli. Therefore, the HC-Pro was expressed together with a maltose binding protein (MBP) at the N-termini to produce high amounts of the protein in a soluble form, and to enable a simple purification. The functional analysis of the MBP-HA-HC-ProFRNK protein by in vitro studies using artificial siRNAs, resulted in a size-specific binding of 21 bp siRNAs. Moreover, the analysis of the in vitro binding of different miRNAs from A. thaliana and human using the recombinant HC-ProFRNK protein from bacteria provides no correlation between the number and position of mismatches of the miRNA heteroduplex and the binding capacity. In contrast, the mutation of the MBP-HA-HC-ProFINK protein apparently resulted in a loss of binding of sRNA molecules. These results confirmed the observations of the gel shift analysis achieved with the recombinant HC-Pro proteins from plants. Analyzing the effect of host proteins affecting the in vitro binding capacity of the HC-Pro should identify this factor and give detailed information about the function and mechanism supporting RNA binding of HC-Pro. A fractionation of an A. thaliana total protein extract and functional analysis of the fractions identified a protein with unknown function, containing a cupin domain (QP), which plays a role in the in vitro binding of sRNA molecules by the HC-Pro. This putative host factor was cloned and recombinant expressed in E. coli to further characterize and prove the effect on small RNA binding. The functional analysis by using gel-shift assays revealed that the Trx-QP-His protein was affecting the siRNA binding by the recombinant MBP-HA-HC-Pro protein in a concentration-dependent manner. Additionally, a fractionated N. benthamiana protein extract showed the same effect on siRNA binding by the HC-Pro. Moreover, protein extracts from N. tabacum and the host plant of ZYMV Zucchini showed no effect. The multifunctional HC-Pro from potyviruses contains an autoproteolytic function to process the polyprotein together with the P1 and NIa-proteinase into mature proteins. HC-Pro catalyzes the autoproteolytic cleavage on its own C-termini at the Gly-Gly dipeptid in the polyprotein at the transition to the P3 protein. The TEV HC-Pro has been identified as a cysteine proteinase with the amino acids Cys-345 and His-418 in the catalytic active domain. In order to identify the proteolytic active domain of ZYMV HC-Pro, recombinant MBP:HA-HC-Pro:GFP fusion proteins from E. coli and different mutants containing either deletions or point mutations at the C-termini of the HC-Pro protein were analyzed. We show that a point mutation at the transition between HC-Pro and GFP, as well point mutations of the conserved catalytic amino acids of TEV HC-Pro in the ZYMV HC-Pro protein had no effect on the processing of the GFP. A catalytic active domain was localized in the stretch of amino acids 350-358. The deletions of Asn-353 or Glu-356 cause a drastic reduction of the proteolytic activity of ZYMV HC-Pro.

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Metadaten
Author:Marc W. Füllgrabe
URN:urn:nbn:de:hebis:30-77830
Referee:Michael Wassenegger
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/06/18
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2010/06/11
Release Date:2010/06/18
Tag:HC-Pro; Potyviren; ZYMV; sRNA-Bindung
HC-Pro; ZYMV; autoproteolysis; potyvirus; sRNA-binding
GND Keyword:Autoproteolyse
HeBIS-PPN:224334360
Institutes:keine Angabe Fachbereich / keine Angabe Institut
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht