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Juan-Jose Garcia-Celma

• A solid-supported membrane (SSM) is an alkanethiol/lipid hybrid membrane with comparable lipid mobility, conductivity, and capacitance than a black lipid membrane (BLM). However, mechanical perturbations, which usually destroy a BLM, do not influence the life-time of a SSM, which is mechanically so stable that solutions may be rapidly exchanged at its surface. This key property has been utilized in this thesis to characterize electrophysiologically two bacterial secondary active transporters (MelB and LacY) as well as to investigate the specific interactions between ions and lipid membranes. These three different projects are summarized below: (1) The properties of lipid membranes, which represent the most important biological interface between intracellular and extracellular compartments, are essentially modulated by the ionic composition of the surrounding aqueous medium. To investigate specific interactions between ions and lipid membranes, solutions of different ionic composition were exchanged at the surface of a SSM through a flow system. This solution exchange resulted in charge translocations that were interpreted in terms of binding of the ions to the lipid headgroups at the SSM surface. We found that chaotropic anions and kosmotropic cations are attracted to the membrane independent of the membrane composition. In particular, the same behaviour was found for lipid headgroups bearing no charge like monoolein. This general trend is modulated by the electrostatic interaction of the ions with the lipid headgroup charge. Our experimental results are in agreement with recent molecular dynamic simulations of PC membranes. (2) Rapid solution exchange on a solid-supported membrane (SSM) is investigated using fluidic structures and a solid-supported membrane in a wall jet geometry. The flow was analyzed with a new technique based on specific ion interactions with the surface combined with an electrical measurement. The critical parameters affecting the time course of the solution exchange and the transfer function describing the time resolution of the SSM system were determined. The experimental data indicate that the solution transport follows a plug flow geometry while the rise of the surface concentration can be approximated by Hagen Poiseuille flow with ideal mixing at the surface of the SSM. Using an improved cuvette design a solution exchange as fast as 2 ms was achieved at the surface of a solid supported membrane. As an application of the technique the rate constant of a fast electrogenic reaction in the melibiose permease MelB, a bacterial (Escherichia coli) sugar transporter, is determined. For comparison, the kinetics of a conformational transition of the same transporter was measured using stopped-flow tryptophan fluorescence spectroscopy. The relaxation time constant obtained for the charge displacement agrees with that determined in the stopped-flow experiments. This supports the previous proposition that upon sugar binding MelB undergoes an electrogenic conformational transition with a rate constant of k ~ 250 s-1. (3) Electrogenic events due to activity of wild-type lactose permease from Escherichia coli (LacY) were investigated with proteoliposomes containing purified LacY adsorbed on a solid-supported membrane electrode. Downhill sugar/H+ symport into the proteoliposomes generates transient currents. Studies at different lipid to protein ratios and at different pH values, as well as inactivation by N-ethylmaleimide, show that the currents are due specifically to the activity of LacY. From analysis of the currents under different conditions and comparison with biochemical data, it is apparent that the predominant electrogenic event in downhill sugar/H+ symport is H+ release. In contrast, LacY mutants E325A and C154G, which bind ligand normally but are severely defective with respect to lactose/H+ symport, exhibit a minor electrogenic event upon addition of LacY-specific substrates, representing only 6% of the total charge displacement of the wild-type. This activity is due either to substrate binding per se or to a conformational transition following substrate binding. We propose that turnover of LacY involves at least two electrogenic reactions: (i) a minor reaction that occurs upon sugar binding and is due to a conformational transition in LacY; and (ii) a major reaction due to cytoplasmic release of H+ during downhill sugar/H+ symport, which is the limiting step for this mode of transport.
• Eine festkörperunterstützte Membran (SSM: solid-supported membrane) ist eine Alkanthiol-/Lipid-Mischmembran mit einer vergleichbaren Lipidmobilität, Leitfähigkeit und elektrischen Kapazität wie eine schwarze Lipidmembran. Jedoch beeinflussen mechanische Störungen, die normalerweise eine BLM zerstören, die Lebensdauer der SSM nicht, da diese mechanisch so stabil ist, dass Lösungen auf ihrer Oberfläche schnell ausgetauscht werden können. Diese wichtige Eigenschaft wurde in dieser Doktorarbeit genutzt, um zwei bakterielle sekundäre aktive Transporter elektrophysiologisch zu charakterisieren und die spezifischen Wechselwirkungen zwischen Ionen und Lipidmembranen zu untersuchen. Diese drei verschiedenen Projekte sind im Folgenden zusammengefasst: (1) Die Eigenschaften von Lipidmembranen, die die wichtigste biologische Schnittstelle zwischen dem Zellinneren und dem Zelläußeren darstellen, werden durch die ionische Zusammensetzung des umgebenden wässrigen Mediums beeinflusst. Um die spezifischen Wechselwirkungen zwischen Ionen und Lipidmembranen zu untersuchen, wurden Lösungen mit verschiedenen ionischen Zusammensetzungen durch ein Durchflusssystem auf der SSM-Oberfläche ausgetauscht. Dieser Lösungsaustausch resultierte in Ladungsverschiebungen, die hinsichtlich der Bindung der Ionen an die Lipid-Kopfgruppen auf der SSM-Oberfläche interpretiert wurden. Wir fanden heraus, dass die chaotropischen Anionen und kosmotropischen Kationen von verschiedenen Membranzusammensetzungen angezogen werden. Interessanterweise konnte dieser Trend auch bei einem nicht geladenen Lipid beobachtet werden. Dieser generelle Trend wird durch elektrostatische Wechselwirkungen der Ionen mit Ladungen auf der Lipid-Kopfgruppe beeinflusst. Tatsächlich stimmen unsere Versuchsergebnisse mit neuesten molekulardynamischen Simulationen von PC-Membranen überein. (2) Der Lösungsaustausch auf einer SSM wurde für verschiedene Durchflusssysteme untersucht. Die Strömung wurde mit einer neuen Technik, basierend auf spezifischen Wechselwirkungen von Ionen mit der SSM-Oberfläche in Kombination mit einer elektrischen Messung, analysiert. Die kritischen Parameter, die den Zeitverlauf des Lösungsaustausches und die Transferfunktion des Systems beeinflussen, wurden festgelegt. Die experimentellen Daten deuten darauf hin, dass ein Zwischenzustand zwischen einer idealen “plug flow“ und der Hagen-Poiseuille Strömung beobachtet werden kann. Die Zuckerbindung an die Melibiose Permease (MelB) von Escherichia coli in Gegenwart von Na+ resultiert in einer elektrogenen Konformationsänderung. Aufgrund der begrenzten Zeitauflösung dieser Experimente könnte der Reaktionsgeschwindigkeitskonstante dieser Konformationsänderung jedoch nur ein Wert von mindestens k > 50 s-1 zugeordnet werden. Ein neues Küvettendesign, in Verbindung mit einem Dekonvolutionsalgorithmus nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate, erlaubte die erneute Erforschung und akkurate Bestimmung dieser Konformationsänderung. Desweiteren ist die Geschwindigkeitskonstante, die sich aus den elektrischen Messungen ergeben hat, sehr ähnlich derjenigen, die aus Messungen von substratinduzierten Konformationsänderungen mit „stopped-flow“ Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie resultiert. Beide Ergebnisse lassen darauf schließen, dass MelB bei Zuckerbindung eine elektrogene Konformationsänderung mit einer Reaktionsgeschwindigkeitskonstante von k ~ 250 s-1 durchmacht. (3) Die erste erfolgreiche elektrophysiologische Studie von LacY wird, unter Einsatz aufgereinigter, in Proteoliposomen rekonstituierter Proteine, mit SSM-basierter Elektrophysiologie gezeigt. Der „bergab“ Zucker/Protonen-Symport in Proteoliposomen generiert transiente Messströme. Untersuchungen mit unterschiedlichen Lipid- zu Protein- Verhältnissen und unterschiedlichen pH-Werten zeigen, dass die Ströme durch die Aktivität von LacY entstehen. Übereinstimmend hiermit werden die Ströme durch Behandlung mit N-Äthylmaleimid blockiert. Die Mutanten E325A und C154G LacY binden Substrate ebenso gut wie der Wildtyp, aber zeigen extrem niedrige Transportaktivitäten. Beide zeigen eine niedrigere elektrogene Reaktion bei Zuführung LacY spezifischer Substrate (nur 6% der gesamten Ladungsverschiebung, die beim Wildtyp LacY beobachtet wurde). Diese Aktivität resultiert entweder aus Substratbindung per se oder aus einer Konformationsänderung nach der Substratbindung. Es wird vermutet, dass der „bergab“ Zucker/Protonen-Symport bei LacY mindestens zwei elektrogene Reaktionen involviert: eine schwach elektrogene Reaktion, die aufgrund der Zuckerbindung erfolgt und einer elektrogenen Konformationsänderung in LacY zuzuschreiben ist; und eine stark elektrogene Reaktion, die vermutlich auf eine zytoplasmische Abgabe von H+ während des „bergab“ Zucker/Protonen-Symports zurückzuführen ist, was den ratenlimitierenden Schritt für diese Art von Transport darstellt. Diese Interpretation stimmt überein mit einer Vielzahl an biochemischen und biophysischen Daten.