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Careen Katryniok

• 5-lipoxygenase (5-LO) is the key enzyme in the formation of inflammatory leukotrienes, which are mediators of inflammation and allergy. The 5-LO catalyses the oxidation of arachidonic acid to 5-HPETE and subsequently to LTA4. The leukotrienes are involved in the development and maintenance of inflammatory diseases, like asthma and allergic rhinitis. Additionally, 5-LO is overexpressed in some cancer types, although its relevance is still not fully understood. 5-LO expressing cells are B- lymphocytes and cells of myeloid origin like monocytes, macrophages and granulocytes. The 5-LO promoter lacks a TATA or CCAT box and covers two CpG islands. These are characteristics of a housekeeping gene, but as the 5-LO is not expressed ubiquitiously, the expression of the 5-LO is tightly regulated. Epigenetic mechanisms were known to be involved in the control of the 5-LO expression. The HDAC inhibitor TsA significantly induced the transcriptional activity of the 5-LO promoter in reporter gene assays as well as on 5-LO mRNA transcript level in MM6 cells. The GC-boxes GC4 and GC5 in the proximal 5-LO promoter were identified to be essential for the TsA effect, as deletion of these element led to an attenuated TsA effect in reporter gene assay. Recruitment of the transcription factors Sp1 and Sp3 and the RNA polymerase II to the 5-LO promoter was detectable after TsA treatment in MM6 cells by chromatin immunoprecipitation assays (ChIP), while the acetylation status of histone H4 remained unchanged. Likewise it is known that DNA methylation leads to silencing of 5-LO expression in-vitro and in-vivo. The 5-LO promoter is densely methylated in the cell line U937, but unmethylated in HL-60 cells and - elucidated in this study - also in MM6 cells. Reporter gene assays with in-vitro methylated 5-LO promoter containing plasmids revealed that the frequency of methylated CpGs is directly proportional to reduction of 5-LO promoter activity. Incubation of U937 cells with 5-AdC, an inhibitor of DNA methyltransferases, was able to reactivate 5-LO transcription and to demethylate CpG dinucleotides. In the first part of this study the mechanism of TsA induced promoter activation was further investigated. I elucidated the mechanism of Sp1 and Sp3 recruitment to the 5-LO promoter after TsA treatment. Immnoprecipitation assay was used to detect a transcription factor complex containing Sp1 or Sp3 interacting with HDAC proteins, which might change its composition after TsA treatment. Besides the posttranslational modifications of the transcription factors Sp1 and Sp3 after TsA treatment were investigated, potentially causing an increased interaction of the proteins with the 5-LO promoter. Both aspects and their response in HDAC inhibition have been described. TsA did not affect the composition of the Sp1/HDAC1/HDAC2 complex. Sp3 was not located in a complex with the HDAC enzymes. Acetylation of Sp1 and Sp3 was detectable, but no change occurred after TsA treatment. Since neither release of the transcription factors off a complex, nor alterations in posttranslational modifications of Sp1 and Sp3 are the reason for the increased Sp1 and Sp3 binding to the 5-LO promoter, I elucidated alterations in the chromatin structure. The acetylation status of the histone proteins H3 and H4, as well as the chromatin marks H3K4me3, representing active chromatin, and H3K9me, representative for repressive state, were investigated. Additionally, the time course of the TsA effect was determined on 5-LO mRNA level using real-time PCR. The acetylation status of the histone proteins on the 5-LO core promoter correlated with the basal 5-LO mRNA transcript expression in MM6, HL-60 and U937 cells. The highest 5-LO mRNA level was detectable in MM6 cells, followed by HL-60 cells. The lowest 5-LO mRNA level was detected in 5-LO promoter methylated U937 cells. The order of the basal 5-LO mRNA expression of the three cell lines correlates with the basal acetylation status of histone proteins H3 and H4. In MM6 cells the highest basal levels in acH3 and acH4 were detected, followed by HL-60 and U937 cells. Moreover, the data obtained in U937 cells revealed that the correlation between DNA methylation and histone hypoacetylation is alike on the 5-LO promoter. TsA treatment induced the 5-LO mRNA level in the three cell lines with different intensity: 5-LO mRNA level in MM6 cells was induced 11-fold, in HL-60 cells 6- fold and in U937 cells 4- fold. The histone acetylation and methylation levels on the 5-LO promoter after TsA incubation were investigated. No increase in acH3 and acH4, but in H3K4me3 was detectable in MM6 cells by ChIP assay. HL-60 cells showed an increase in acH3 and acH4 as well as in H3K4me3. H3K9me was only detectable in untreated U937 cells, but disappeared after TsA treatment, while acH3, acH4 and H3K4me3 increased constantly after TsA treatme nt. A strong correlation between the histone modifications and the time course of the mRNA expression was detectable in all three cell lines. The combination of the posttranslational modifications acH3, acH4 and H3K4me3 led to a fast effect in transcriptional activation and the maxima of acH3 and acH4 were usually associated with the maximum in 5-LO mRNA transcript level. An increase in H3K4me3 alone, as detected in MM6 cells, led to continuous increase in the 5-LO mRNA expression with a late maximum. Additionally, we detected a slight overall decrease in 5-LO promoter methylation in U937 cells after TsA treatment. This fact taken together with the observed histone modifications could explain the 4- fold response in 5-LO mRNA level to TsA treatment of the methylated cell line U937. Another aim of the present study was to identify the specific HDAC enzymes involved in the 5-LO promoter regulation. Reporter gene assays and real-time PCR with selective HDAC inhibitors revealed that HDACs of class I are involved in 5-LO promoter regulation, namely HDAC 1, 2 and 3. The influence of each of the enzymes seemed to depend on the cell type, as inhibition of HDACs 2, 3 strongly induced 5-LO promoter activity in reporter gene assay in HeLa cells, whereas in MM6 cells HDACs 1 and 2, 3 seemed to be responsible for the 5-LO promoter regulation, measured as 5-LO mRNA level. The HDACs of class IIa and class III are not involved in the regulation of 5-LO mRNA expression. The second part of this study investigated the influence of MBD proteins on the methylated 5-LO promoter and the 5-LO mRNA expression. ChIP assays revealed MBD1, 2 and MeCP2 protein binding to the proximal 5-LO promoter in U937 cells. MBD1 was detectable on the 5-LO promoter in unmethylated HL-60 cells, while no MBD protein was located on the 5-LO promoter in MM6 cells. To elucidate the functional role of the MBD proteins, stable knocked down of MBD proteins was established in U937 cells. 5-LO mRNA transcript level was determined in the knock down clones by real-time PCR. The 5-LO transcript level was increased in all knock down samples. MBD2 knock down clones showed the highest effect in activating 5-LO with a 3- and 4.4-fold increase in the 5-LO mRNA level, followed by MBD1 (3.5- fold) and MeCP2 (2.5-fold) knock down clones. A combined participation of these three enzymes in the corepression of the methylated 5-LO promoter is indicated. Taken together, the data reveal that epigenetic mechanisms are strongly involved in the regulation of 5-LO transcription and might function as a crucial control mechanism of 5-LO expression.
• Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym bei der Bildung der proentzündlichen Leukotriene. Sie katalysiert den Einbau von molekularem Sauerstoff in die Arachidonsäure und katalysiert die Bildung von 5-HPETE und nachfolgend von LTA4. Die Leukotriene spielen eine Rolle bei der Entstehung von Autoimmunkrankheiten wie Asthma oder allergischem Schnupfen. Zudem ist eine erhöhte Leukotrienbildung in verschiedenen Krebsarten beschrieben worden. Ihre Bedeutung im Krebsgeschehen ist jedoch noch nicht vollkommen aufgeklärt. Die 5-LO wird in B-Zellen und in myeloiden Zellen wie Monozyten, Makrophagen oder Granulozyten exprimiert. Der 5-LO-Promoter enthält keine TATA oder CCAT-Box und umfasst zwei CpG-Inseln. Dies entspricht der Promoterstruktur eines Haushaltsgenes. Da die 5-LO aber nicht ubiquitär exprimiert wird, unterliegt die Regulation der 5-LO-Transkription spezifischen Kontrollmechanismen. Es ist bekannt, dass epigenetische Mechanismen die 5-LO-Expression beeinflussen. TsA, ein HDAC-Hemmer, verursacht einen signifikanten Anstieg der 5-LO-Promoteraktivität sowohl im Reportergenexperiment als auch auf mRNA-Transkriptebene. Die GC-Boxen GC4 und GC5, die im vorderen Promoterbereich lokalisiert sind, spielen dabei eine essentielle Rolle. Die Deletion dieser beiden Strukturelemente schwächt die Induzierbarkeit durch TsA stark ab. Im Chromatinimmunopräzipitationsexperiment (ChIP) konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 und die RNAPolymerase II nach TsA-Behandlung stärker an den 5-LO-Promoter binden, der Acetylierungsstatus des Histonproteins H4 in MM6 Zellen jedoch unverändert bleibt. Im ersten Teil der vorliegenden Studie sollte der Mechanismus aufgeklärt werden, welcher der durch TsA induzierten 5-LO Promoteraktivierung zugrunde liegt. Zunächst wurde ermittelt, weshalb Sp1 und Sp3 nach TsA-Behandlung verstärkt an den 5-LO Promoter binden. Es wurden Immonopräzipitationsexperimente durchgeführt, um einen vermuteten Komplex aus Sp1 bzw. Sp3 mit den HDAC-Proteinen 1 und 2 zu detektieren. Weiterhin wurde untersucht, ob sich nach TsA-Behandlung eine Änderung der Komplexstruktur ergibt, welche zur Freisetzung von Sp1 führt. Außerdem wurde die posttranslationale Acetylierung von Sp1 und Sp3 nach TsA-Inkubation untersucht. Beide Regulationsmechanismen sind für Sp1-Bindung nach TsA-Behandlung an anderen Zielpromotern beschrieben worden. Es konnte ein Komplex detektiert werden, welcher die Proteine Sp1/HDAC1/HDAC2 enthält. Allerdings ergab sich keine Änderung der Zusammensetzung desselben nach TsABehandlung.Ein Komplex mit Sp3-Beteiligung wurde nicht ermittelt. Es konnten auch Sp1 und Sp3 im acetylierten Status nachgewiesen werden, die TsA-Behandlung zeigte hier aber ebenfalls keinen zeitlichen Einfluss auf den Grad der Modifikation. Da weder die veränderte Zusammensetzung eines Transkriptionsfaktorkomplexes noch posttranslationale Modifikationen eine Erklärung für die gesteigerte Sp1- und Sp3-Bindung an den 5-LO Promoter lieferten, wurde die Frage aufgeworfen, ob sich Änderungen in der Chromatinstruktur am proximalen 5-LO-Promoter nach TsA-Behandlung nachweisen lassen. Sowohl der Acetylierungsstatus der Histonproteine H3 und H4, als auch der Status von H3K4me3, ein Marker für aktives Chromatin, und H3K9me, im Promoterbreich ein Kennzeichnen für inaktives Chromatin, wurden untersucht. Außerdem wurde der Zeitverlauf des TsA-Effekts auf 5-LO-mRNA Ebene mittels Echtzeit-PCR in allen drei Zelllinien ermittelt. Der Acetylierungsstatus der Histone H3 und H4 am proximalen 5-LOPromoter korreliert mit den basalen 5-LO-mRNA Spiegeln in den drei Zellinien MM6, HL-60 und U937. Die höchsten basalen 5-LO-mRNA Spiegel wurden in MM6-Zellen gemessen, gefolgt von HL-60-Zellen. Die niedrigste 5-LO-mRNA-Expression wurde in den 5-LO-promotermethylierten U937-Zellen gefunden. Diese Reihenfolge der basalen 5-LO-Promoteraktivität, gemessen als 5-LO-mRNA, spiegelt sich im Acetylierungsstatus der Histonproteine H3 und H4 am jeweiligen Promoter wider. MM6-Zellen weisen den höchsten basalen Acetylierungsgrad der Histone H3 und H4 auf, gefolgt von HL-60-Zellen und U937-Zellen. Weiterhin zeigte sich, dass Histonhypoacetylierung und DNAMethylierung am 5-LO Promoter korrelieren, repräsentiert durch die Zelllinie U937. TsA-Behandlung aktivierte die 5-LO-mRNA-Expression in allen drei Zelllinien, allerdings in unterschiedlichem Ausmaß: in MM6-Zellen 11-fach, in HL-60-Zellen 6-fach und in U937-Zellen 4-fach nach 24-stündiger Behandlung. Daher wurde die Histonacetylierung und –methylierung am proximalen 5-LO-Promoter nach TsA-Behandlung genauer untersucht. Es konnte keine Zunahme an acetyliertem Histon H3 und H4, dafür allerdings ein Anstieg des Markers H3K4me3 in MM6-Zellen im ChIP-Experiment gezeigt werden. In HL-60-Zellen war sowohl eine Zunahme des Acetylierungsstatus, als auch des Markers H3K4me3 nachzuweisen. Der Repressionsmarker H3K9me war nur in unbehandelten U937-Zellen nachweisbar, jedoch nicht mehr nach TsA-Behandlung. Hier war dafür ein Anstieg der acetylierten Histone H3 und H4 und H3K4me3 zu beobachten. Die zeitliche Steigerung der Histonacetylierung und -methylierung steht in direkter Korrelation zum Zeitverlauf der vermehrten 5-LO-mRNA-Expression nach der TsABehandlung in allen drei Zelllinien. Das zeitliche Maximum der Histonacetylierung korrelierte mit dem Höchstwert des 5-LO mRNA-Levels in HL-60- und U937-Zellen. Der Anstieg der H3K4me3-Methylierung alleine, wie in MM6-Zellen gezeigt, resultierte dagegen in einer stetigen Aktivierung der 5-LO Transkription und einem späteren Maximum des 5-LO-mRNA-Spiegels. Zusätzlich konnte ich nachweisen, dass das Gesamtmaß der DNA-Methylierung des 5-LO-Promoters in U937-Zellen nach TsA-Behandlung leicht abnimmt. Die Kombination aus Histonmodifikationen und geringerem Methylierungsmaßes erklärt die 4- fache Steigerung der 5-LO-mRNA-Expression in U937 Zellen nach TsA-Behandlung. Ein weiteres Ziel dieser Studie stellte die Identifizierung derjenigen HDAC-Enzyme dar, welche an der Regulation der 5-LO-Transkription beteiligt sind. Selektive HDAC-Inhibitoren wurden in Reportergenexperimenten und Echtzeit-PCR getestet und es zeigte sich, dass die HDACs der Klasse I, vor allem die HDACs 1, 2 und 3 für die 5-LO-Promoteraktivierung verantwortlich sind. Welches der Enzyme in welchem Ausmaß die Promoteraktivität beeinflusst, scheint sich von Zelllinie zu Zelllinie zu unterscheiden. Die Hemmung der HDACs 2 und 3 zeigte die stärkste Promoteraktivierung in HeLa-Zellen, den Modellzellen für das Reportergenexperiment. In MM6 Zellen, wo das 5-LO-mRNA Level mittels Echtzeit-PCR ermittelt wurden, zeigte die Hemmung von HDAC 1 und 2, 3 den stärksten Effekt. Die HDAC-Enzyme der Klassen IIa und III waren an der transkriptionellen Aktivierung der 5-LO nicht beteiligt. Der zweite der Te il der Arbeit befasste sich mit dem Einfluss der methyl-DNA-bindenden MBD-Proteine auf die Regulation der Transkription des 5-LO-Promoters. DNA-Methylierung schaltet die 5-LO-Expression in-vitro und in-vivo aus. Der Methylierungsgrad des 5-LO-Promoters ist in 5-LO-negativen U937-Zellen sehr hoch, während HL-60-Zellen und, wie in dieser Studie gezeigt, auch MM6-Zellen einen unmethylierten Promoter aufweisen. In Reportergenexperimenten mit in-vitro methylierten Plasmiden zeigte sich eine direkte Korrelation zwischen dem Grad der CpG-Methylierung und der Hemmung der 5-LO-Promoteraktivität. Nach der Behandlung von U937-Zellen mit 5-AdC, einem DNA-Methyltransferaseinhibitor, war die 5-LO-Promoteraktivität wiederhergestellt und eine geringe Anzahl an CpG Nukleotiden im proximalen Promoter lag unmethyliert vor. In der vorliegenden Arbeit konnte ich mittels ChIP-Experimenten zeigen, dass die Proteine MBD1, 2 und MeCP2 an den proximalen 5-LO-Promoter von U937-Zellen binden. Das Protein MBD1 wurde auch am 5-LO-Promoter in unmethylierten HL-60-Zellen gefunden, dagegen keines der MBD-Proteine in MM6 Zellen. Um den funktionellen Einfluss der MBD-Proteine auf den 5-LO-Promoter zu ermitteln, wurden diese Proteine in ihrer Expression in U937-Zellen stabil unterdrückt (stabiler Knock-down). Der Effekt auf die 5-LO-mRNA Expression wurde mittels Echtzeit-PCR auf mRNA-Ebene ermittelt. Die 5-LO-mRNA Expression war in allen getesteten Klonen gesteigert. Die MBD2-knockdown-Klone zeigten den stärksten Einfluss auf die 5-LO-mRNA-Expression (3- und 4,4-fach), gefolgt vom MBD1-Klon (3,5-fache Steigerung) und dem MeCP2-Klon (2,5-fache Steigerung). Somit scheint es, dass alle drei Enzyme an der Hemmung der 5-LOTranskription am methylierten 5-LO-Promoter beteiligt sind. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass epigenetische Mechanismen einen sehr großen Einfluss auf die 5-LO-Transkription haben: Eine offene Chromatinstruktur am proximalen 5-LO-Promoter verursacht ein signifikant höheres 5-LO-mRNA Level als eine geschlossene Chromatinstruktur. Bei dieser Regulation sind die Histonacetylierung und die Methylierung an H3K4me3 von Bedeutung. An den methylierten proximalen 5-LOPromoter in U937-Zellen, an dem nur sehr geringe 5-LO-mRNA-Transkription stattfindet, binden die MBD-Proteine MBD1, 2 und MeCP2. Diese Bindung führt zu einer Hemmung der Transkriptionsrate und zu niedriger 5-LO-mRNA-Expression. Epigenetische Mechanismen stellen somit ein wesentliches Kontrollinstrument für die 5-LO-Expression dar.