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Valerii M. Sukhorukov

• Mitochondria are dynamic organelles indispensible for viability of eukaryotic cells. Diffusion of proteins in mitochondrial membranes is a prerequisite for the correct functionality of the organelles. However, its study is made complicated due to the nontrivial geometry, small size and positional instability of the organelle, restricting the usability of regular experimental methods and theoretical understanding of acquired data. Therefore, here the molecular transport along the main mitochondrial axis was investigated using highly accurate computational methods combining them with traditional experimental approaches. Using recently reported electron microscopic tomography data concerning the constitution of mitochondria [Fre02], a lattice model of the inner mitochondrial membrane (IM) reproducing its structure in great details was built up. With Monte Carlo (MC) simulations of particle dynamics on this model, it was found that the membrane geometry induces nonlinear effects in the motion of molecules along the mitochondrial axis, which in turn lead to a transient violation of the 2nd Fick?s equation. We show that mere curvature of the IM resulting from the presence of cristae is sufficient for the emergence of transient anomalous diffusion (TAD) in the membrane. The MC calculations have enabled an accurate estimation of regularities in the extent of deviations from the normal regime, therefore allowing us to propose non-homogenous power law as a suitable generalization of the current approach to the analysis of experimental data for the transient dynamics. The general cause of TAD resulting from the membrane curvature alone, without any involvement of specific inter-particle interactions prompted us to predict the similar dynamical effect also for other curved cellular membranes, be it diffusion in endoplasmic reticulum or in plasma membrane of cells possessing dense microvilli. The data indicate that the geometry-induced anomalous diffusion should be easily detectable with current experimental methods, but only in the restricted range of time scales corresponding to high temporal resolution. Until now, experimental measurements of molecular diffusion in biological membranes indiscriminately assumed either pure normal or pure anomalous diffusion schemes for the analysis of data acquired in very wide range of temporal resolutions, which often lead to ambiguities in the interpretation of diffusion parameters. The MC calculations have clearly illustrated the necessity for a more subtle treatment of experimental conditions: the assumption of pure Gaussian diffusion model is justified only if the applied temporal resolution is sufficiently low (as is often the case when using scanning techniques exemplified further); otherwise, the transient regime should be tested for by means of the non-homogenous power function. In the second part of the study the Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) with the laser scanning microscope is introduced as a method of choice for studying protein mobility within mitochondrial membranes. The conventional FRAP methodology [Axe76] was extended to enable its application for the determination of confined diffusion with conventional laser scanning microscopes which allowed us to communicate for the first time the direct measurement of protein diffusion in mitochondrial membranes of living cells. This is achieved through adaptation of FRAP data analysis to account for the spatial dimensions of the organelle and the spatiotemporal pattern of light pulses induced by the microscope. The experimental circumstances existing during the particular measurement session are computationally recreated and this way the best suited values of diffusion parameters are found. The method is validated experimentally for four FP-tagged mitochondrial membrane proteins: the IM OxPhos complexes F1F0 ATPase and cytochrome c oxidase and for Tom7 and hFis1 - components of the mitochondrial protein import and fission machineries respectively localized in the outer membrane. We find that for all proteins simple normal diffusion is not a sufficient description. In the inner membrane, diffusion coefficient of F1F0 ATPase expressed in HeLa cell line is found to be 0.2 ?m2/s, with more than 1/3 of the protein molecules being immobilized, while cytochrome c oxidase (in CEF primary cells) demonstrated a similar diffusivity pattern (0.4 ?m2/s, 30% immobile). In the outer membrane, the D (0.7 ?m2/s) and immobile fraction (7-8%) of GFP-Tom7 and GFP-hFis1 (both in HeLa cells) are identical, which designates a substantial difference in comparison to the IM protein mobility. Diffusion coefficients of mitochondrial membrane proteins studied here lay in the intermediate region between those measured in artificial bilayers and in plasma membranes. Protein crowding and intermolecular interactions will be among the major causes responsible for the detected slowdown of diffusion.
• Mitochondrien sind dynamische, für die Entwicklungsfähigkeit eukaryotischer Zellen unentbehrliche Organellen. Grundvoraussetzung für ihre einwandfreie Funktionalität ist die Diffusion von Proteinen in der mitochondrialen Membran, die aber bis jetzt rätselhaft ist. Hauptgründe hierfür sind die geringe Größe, nicht triviale Geometrie und Lageinstabilitäten der Organellen. Deshalb wurde mittels sehr sorgfältiger und genauer Rechenmethoden in Kombination mit herkömmlichen experimentellen Vorgehensweisen der Molekültransport längs der mitochondrialen Hauptachse untersucht. Mit Monte Carlo Simulationen der Teilchendynamik wurde gezeigt, dass die Geometrie der inneren Membran (IM) nicht lineare Effekte bei der Molekülbewegung längs der Mitochondrien induziert. Dies wiederum hat eine transiente Verletzung des 2-ten Fick'schen Gesetzes zur Folge. Die durch das Vorhandensein der Cristae bedingte Krümmung der IM bewirkt das transiente Auftauchen der anomalen Diffusion, während in quasi-normalen Regimen innerhalb kurz- und langzeitiger Grenzen für den projizierten Diffusionskoeffizienten endliche und feste Werte wiedergewonnen werden. Für diese Fälle hat ein einfaches Flächenskalierungsgesetz sich als ausreichend herausgestellt zur Erklärung der Diffusionskoeffizienten für durchlässige Cristae-Junctions. Innerhalb langzeitiger Grenzen bewirken die geometrischen Beschränkungen eine mehrfache Reduzierung der sichtbaren Mobilität. Methoden der optischen Mikroskopie betreffend wurden Folgerungen gezogen für die experimentelle Beobachtung der Diffusion längs der Mitochondrien: Die Daten zeigen, werden geometrische Effekte nicht angemessen berücksichtigt, führt dies zu signifikanten Fehlinterpretationen bei Messungen der Molekülmobilität in zellulären, krummlinigen Membranen. ''Fluorescence Recovery after Photobleaching'' (FRAP), ausgeführt mit einem Laser Scanning Mikroskop, wurde als Methode zur Erforschung der Proteindiffusion in der mitochondrialen Membran ausgewählt. Die herkömmliche FRAP-Methode [Axe76] wurde erweitert, um sie zur Bestimmung begrenzter Bewegungen nutzbar zu machen. Dies versetzte uns in die Lage, erstmalig die direkte Messung der Diffusion von Proteinen in der Mitochondrienmembran lebender Zellen bekannt zu machen. Erreicht wird dies, indem bei der FRAPDatenanalyse die räumlichen Dimensionen der Organelle und die raumzeitliche Reihenfolge der durch das Mikroskop verursachten Lichtimpulse berücksichtigt werden. Die vorgeschlagene Methode bildet rechnerisch die experimentellen Verhältnisse nach, die während der Messsitzungen existierten. Auf diese Weise lässt sich die beste Werteanpassung der Diffusionsparameter erzielen. Die Gültigkeit der Methode wird experimentell für vier FP-markierte mitochondriale Membranproteine bestätigt, und zwar für die IM OxPhos Komplexe F1F0 ATPase, und cytochrome c oxidase, und auch für Tom7 und hFis1 - die Komponenten der Import- und Teilungsmaschinerie der mitochondrialen Proteine, lokalisiert in der äußeren Membran. Für den Diffusionskoeffizienten der inneren Membran wurde für die F1F0 ATPase (in HeLa Zellenlinien) ein Wert von 0.2 μm2/s ermittelt, wobei mehr als 1/3 der Proteinmoleküle immobilisiert sind. Cytochrome c oxidase (in CEF Primärzellen) zeigte eine ähnliche Diffusität (0.4 μm2/s, 30% immobil). Bezüglich der äußeren Membran sind der Diffusionskoeffizient (0.7 μm2/s) und die immobile Fraktion (7-8%) von GFPTom7 und GFP-Fis1 (beide in HeLa Zellen) identisch, was im Vergleich mit der Proteinmobilität der IM eine beträchtliche Differenz erkennen lässt. Die statistisch signifikante Abnahme der immobilen Fraktion von GFP-Tom7 auf 2% nach einstündiger Hemmung der zellulären Proteinproduktion zeigt an, dass Tom7 auf ladungsabhängige Weise immobilisiert wird mit erhöhter Immobilisierung bei aktivem Transport von Proteinen durch die äußere Membran. Die ermittelten Diffusionskoeffizienten der Mitochondrienmembran sind viel kleiner als jene, die in künstlichen Doppelschichten gemessen wurden. Proteinüberbevölkerung und intermolekulare Wechselwirkungen sind zu den Hauptursachen zu zählen für die nachgewiesene Verlangsamung der Diffusion.