Präklinische Testung nanopartikulärer Arzneistoffsysteme auf Basis von humanem Serumalbumin zum gezielten Wirkstofftransport

Preclinical testing of nanoparticle based drug delivery systems on basis of human serum albumin for targeted drug delivery

  • Nanopartikuläre Arzneistoffsysteme sind ein viel versprechender Ansatz die speziellen Anforderungen, die an eine Arzneiform gestellt werden, zu erfüllen. Mit ihnen scheint das lang verfolgte Ziel der Pharmaforschung, das gezielte Transportieren ("Drug-Targeting") und das kontrollierte Freisetzen des Arzneistoffs am Wirkort ("Controlled Release") und damit das Minimieren unerwünschter Nebenwirkungen, in greifbare Nähe zu rücken. In der vorliegenden Arbeit konnte durch verschiedene Versuchsansätze in der präklinischen Testung der gezielte Wirkstofftransport zielgerichtet-modifizierter Nanopartikel (NP) auf humanem Serumalbumin (HSA)-Basis sowohl für das spezifische Tumor-Targeting als auch für die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) gezeigt werden. Die NP für das spezifische Tumor-Targeting waren mit dem Zytostatikum Doxorubicin beladen und mit dem tumorspezifischen Liganden Trastuzumab für ein Mammakarzinom-Zellen-Targeting oder DI17E6 für ein Melanom-Zellen-Targeting modifiziert. Ihre zielgerichtete Funktionalität konnte an verschiedenen Target-exprimierenden-Zelllinien gezeigt werden. Dabei konnte ihre spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und subzellulären Verteilung verifiziert werden. Die Ligand-modifizierten NP wurden bei diesen Untersuchungen spezifisch in die Zielzellen aufgenommen, während die unmodifizierten Kontroll-Partikel unspezifisch an der Zellmembran klebten. Die Freisetzung des Doxorubicins in einer biologisch aktiven Form konnte anhand entsprechender Zellviabilitäts-Assays gezeigt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der nanopartikulär transportierte Wirkstoff über den Rezeptor-internalisierenden Aufnahmeweg nicht in den Endosomen oder Lysosomen akkumulierte und damit inaktiv war, sondern dass er in wirksamer Form freigesetzt wurde. Als Besonderheit wurde mit DI17E6 für das spezifische Melanom-Zellen-Targeting ein Antikörper als ziel-orientierter Ligand eingesetzt, der zusätzliche anti-tumorale Eigenschaften hat, die bei der Ankopplung an die NP-Oberfläche erhalten werden sollten. Durch speziell entwickelte in vitro Assays, die auf diese Eigenschaften abzielten, konnte der Erhalt der biologischen Wirksamkeit des Antikörpers bestätigt werden. Mit derartigen nanopartikulären Formulierungen, basierend auf biologisch abbau¬barem HSA, modifiziert mit entsprechenden zielgerichteten Liganden und anti-tumoralen Wirkstoffen, sollte aufgrund der hier gezeigten präklinischen Daten eine spezifische Tumortherapie möglich sein. Zum Überwinden der BHS wurden NP getestet, die mit Apolipoprotein E (ApoE) modifiziert waren. Dabei handelte es sich zum einen um leere NP für Aufnahmemechanismus-Studien und zum anderen um Obidoxim-beladene NP für Transportstudien. Bei Obidoxim handelt es sich um einen Vertreter der Stoffklasse der Oxime. Diese werden als Antidote bei Organophosphat (OP)-Vergiftungen eingesetzt. Oxime können die nach einer OP-Vergiftung inhibierte lebensnotwendige Acetylcholinesterase (AChE) reaktivieren. Da Oxime die BHS aber kaum überwinden können, wird die in den zentralnervösen Kompartimenten inhibierte AChE nicht in therapeutisch ausreichendem Maß erreicht. Daher sollte beispielhaft Obidoxim nanopartikulär-vermittelt über die BHS transportiert werden. Für beide Formulierungen konnte die spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und die subzelluläre Verteilung sowie ihre für ein BHS-Targeting kompatiblen, untoxischen Eigenschaften gezeigt werden. Mit den ApoE-modifizierten unbeladenen NP konnte durch verschiedene Koinkubations- und Hemmexperimente eindeutig die Beteiligung der "Low Density Lipoprotein" (LDL)-Rezeptor-Familie, und besonders des "Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein" (LRP), bei der spezifischen ApoE-vermittelten NP-Aufnahme gezeigt werden. Dabei ließ sich die NP-Aufnahme auf zwei Wegen hemmen. Zum einen konnte von der zellulären Seite aus der beteiligte Aufnahme-Rezeptors mit dem "Receptor Associated Protein" gehemmt werden, wodurch eine spezifische ApoE-vermittelte NP-Aufnahme über eine Rezeptor-Bindung verhindert wurde. Zum anderen konnte aber auch, durch Blockade des ApoE auf der Partikeloberfläche mittels löslicher Fragmente des LRP, die ApoE-vermittelte NP-Aufnahme von nanopartikulärer Seite gehemmt werden. Durch die Kenntnis des Aufnahmemechanismus der nanopartikulären Formulierungen sollte es für zukünftige Entwicklungen im breiten Feld der BHS-Forschung möglich sein, sehr spezifische und effektivere Carrier maßzuschneidern. Zu Untersuchungen des Wirkstofftransports wurden frisch isolierte porcine Gehirnkapillarendothel-Zellen im Transwell-System als adäquates in vitro BHS-Modell etabliert und eingesetzt. Für den Nachweis des tatsächlichen Obidoxim-Transports wurde ein biologischer Assay entwickelt, der gemäß der therapeutischen Funktion von Oximen nach OP-Vergiftungen auf die Reaktivierung OP-vergifteter AChE abzielte. Es konnte gezeigt werden, dass nanopartikuläre Formulierungen tatsächlich einen verbesserten Transport von Obidoximen gegenüber freiem Obidoxim in einem in vitro BHS-Modell vermitteln. Diese nanopartikulären Transportsysteme stellen daher ein bisher einzigartiges, viel versprechendes Hilfsmittel zum Transport von Oximen über die BHS dar. Durch die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen konnte insgesamt gezeigt werden, dass NP auf HSA-Basis für einen zielgerichteten Wirkstofftransport geeignet sind und aufgrund ihrer biokompatiblen, bioabbaubaren Eigenschaften einen viel versprechenden Ansatz für die zukünftige Pharmaforschung darstellen.
  • Nanoparticulate drug delivery systems are a promising approach to achieve the special requirements to a drug delivery system. With them the long pursued goal of the pharmaceutical research, the specific "drug targeting" and the "controlled release" of the drug thus minimizing unwanted side effects seems to get into reach. In the present study the specific drug transport by target-oriented modified nanoparticles (NP) based on human serum albumin (HSA) could be shown by different experiments in the field of preclinical testing both for the specific tumor targeting and for the overcoming of the blood-brain barrier (BBB). The NP for the specific tumor targeting were loaded with the cytostatic drug Doxorubicin and were modified with the tumor-specific ligand Trastuzumab for a breast cancer cell targeting or DI17E6 for a melanoma cell targeting. Their target-oriented functionality could be shown by the use of different target-expressing cell lines. Thereby, their specific cellular binding, uptake and subcellular distribution could be verified. The ligand-modified NP were specifically taken up by the target-expressing cell lines, whereas the unmodified control particles stuck unspecifically on the outer cell membrane. The release of the Doxorubicin in a biologically active form could be shown by adequate cell viability assays. Furthermore, it could be shown that the nanoparticulate transported cytostatic drug over the receptor-internalizing pathway did not accumulate in the Endosomes or Lysosomes and was therefore inactive, but it was released in active form. As a special feature concerning the specific melanoma targeting the antibody DI17E6 was used as a target-oriented ligand, which has additional anti-tumoral characteristics, which should be preserved by the coupling onto the NP surface. The preservation of the biological effectiveness of the antibody could be confirmed by individually developed in vitro assays concerning these special features. Due to the preclinical data shown here, a specific tumor therapy should be possible with such nanoparticulate formulations based on biodegradable HSA, modified with target-oriented ligands and cytostatic drugs. For the overcoming of the BBB NP were tested, which have been modified with Apolipoprotein E (ApoE). Thereby, it concerned empty NP for uptake mechanism studies and Obidoxime loaded NP for transport studies. Obidoxime is a representative of the substance class of the Oximes. They are used as antidotes after organophosphate (OP) poisonings. Oximes can re-activate the essential acetylcholinesterase (AChE) inhibited after an OP poisoning. But Oximes can hardly cross the BBB and therefore do not reach the inhibited AChE in the central nervous system in therapeutically sufficient manner. Therefore, exemplary Obidoxime should be transported individually over the BBB mediated by nanoparticulate drug delivery systems. For both formulations the specific cellular binding, uptake and the subcellular distribution could be shown as well as their non toxic characteristics compatible for a BBB targeting. With the ApoE modified empty NP the participation of the "Low Density Lipoprotein" (LDL)-receptor family, and particularly the "Low Density Lipoprotein Receptor Related protein" (LRP) by the specific ApoE mediated NP uptake could clearly be shown by different co-incubations and inhibition experiments. The NP uptake itself could be inhibited in two ways. On the one hand on the cellular side the involved uptake receptor could be inhibited with the "Receptor Associated protein". Thus a specific ApoE mediated NP uptake by receptor binding was prevented. On the other hand the ApoE mediated NP uptake could be impeded on the nanoparticulate side by blockage of the ApoE on the particle surface by means of soluble fragments of the LRP. Through the knowledge of the transport mechanism of the nanoparticulate formulations it should be possible to tailor very specific and more effective carriers for future developments in the broad field of the BBB research. As an adequate in vitro BBB model for drug transport studies freshly isolated porcine brain capillary endothelial cells were established and used within the Transwell system. For proof of the effective Obidoxime transport a biological assay was developed, which according to the therapeutic function of oximes after OP poisonings aimed at the reactivation of OP inhibited AChE. It could be shown that nanoparticulate formulations really improved the transport of Obidoximes over an in vitro BBB model in comparison to the free Obidoxime. Therefore, these nanoparticulate transport systems represent a unique and promising tool for the transport of Oximes over the BBB. Altogether, it could be shown by the research represented in this work that NP based on HSA are suitable for a specific drug transport and due to their biocompatible, biodegradable nature they are a promising approach in future pharmaceutical research.

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Metadaten
Author:Sylvia Wagner
URN:urn:nbn:de:hebis:30-77465
Referee:Jörg KreuterGND, Hagen von Briesen
Advisor:Hagen von Briesen
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2010
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2010/05/17
Release Date:2010/05/28
Tag:zielgerichtete Chemotherapie
apolipoprotein e; blood-brain barrier; human serum albumin; nanoparticles; specific drug targeting
GND Keyword:Nanopartikel; Targeted drug delivery; Blut-Hirn-Schranke; Apolipoprotein E; Humanes Serumalbumin
Page Number:148
HeBIS-PPN:223662267
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht