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Jana Eckert

• Das West-Nil-Virus (WNV) gehört zur Gruppe des Japan-Enzephalitis-Serokomplexes der Flaviviren, welches in Afrika, Asien und Mittleren Osten sowie in Süd- und Osteuropa seine Verbreitung findet. Das unerwartete Auftreten des Erregers in den USA (New York, 1999) bedingte eine große Zahl an transfusions- sowie transplantations-assoziierten WNV-Infektionen. Derzeit liegen keine Erkenntnisse über die Verbreitung des WNV in der deutschen Blutspenderpopulation vor. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit die Bestimmung der Prävalenz und Inzidenz des Erregers zur Einschätzung der Gefahr von transfusions-assoziierten WNV-Infektionen. Zunächst wurde zur Bestimmung der Prävalenz des Erregers die Sensitivität und Spezifität verschiedener ELISAs (Panbio, Focus und Euroimmun) für die WNV-Antikörpertestung bestimmt. Es zeigte sich, dass WNV starke Kreuzreaktionen mit dem für unsere Breiten relevanten Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME) aufweist. Aus diesem Grund wurde zusätzlich ein FSME-ELISA sowie als Bestätigungstest ein Neutralisationstest verwendet und ein Testalgorithmus entwickelt. Für die Bestimmung der Inzidenz wurde auf den Grundlagen von Hadfield eine WNV-Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) entwickelt und etabliert. Die 95% Nachweisgrenze wurde nach der Entwicklung der RT-PCR auf 54Kop./ml WNV-RNA bezogen auf eine Einzelprobe in einem Minipool bestehend aus acht Blutspenden bestimmt. Das Konfidenzintervall beträgt (CI): 42; 6 - 79; 92 Kopien/ml. Zudem wurde die Sensitivität der automatischen Extraktion mittels des auf magnetischen Festphasen beruhenden Separationsmoduls I mit der WNV-RT-PCR ermittelt. Die 95% Nachweisgrenze lag bei 225Kop./ml WNVRNA((CI): 168; 5 - 314; 3 ) bezogen auf eine Einzelprobe in einem Minipool bestehend aus acht Blutspenden. Aufgrund der etwas schlechteren Sensitivität wurde für die Bestimmung der Inzidenz die manuelle Extraktion durchgeführt. Zudem wurde das kommerzielle WNV Procleix Assay der Firma Chiron verwendet, um alle bisher in Europa aufgetretenen WNV-Stämme zu erfassen. Im Sommer 2004 wurde zunächst die Prävalenz des WNV bestimmt. Hierfür wurden 14:000 aus Hessen stammende Blutspenden von gesunden Spendern untersucht. Initial zeigte sich eine hohe Rate an anti-WNV reaktiven (5; 9 %) Blutspenden, wobei nur 0; 03% der Blutspenden im Neutralisationstest als Anti-WNV positiv bestätigt worden. 0; 15% der bestätigten anti-WNV positiven Blutspenden waren hierbei am ehesten mit Reisen in WNV-Epidemiegebiete assoziiert. Die Bestimmung der Inzidenz erfolgt im darauf folgendem Jahr durch die Untersuchung von 10:976 Blutspenden zusammengefasst in 1:372 Minipools mittels WNV RT-PCR. Von 1:372 Minipools wurden 1:247 Minipools mit dem Procleix WNV Assay untersucht. Beide Untersuchungsmethoden konnten keine WNV-positive Blutspende nachweisen. Insgesamt scheint das WNV -wenn überhaupt- nur in verschwindend geringem Maße in der deutschen Blutspenderpopulation zu exisitieren. Somit besteht derzeit keine Gefahr für transfusions-assoziierte WNV-Infektionen. Dennoch wurden importierte WNV-Infektionen aus Endemiegebieten in Deutschland beschrieben. Durch weitere Veränderungen der klimatischen Gegebenheiten wäre die Einschleppung des WNV nach Deutschland in Zukunft durchaus denkbar. Hierfür steht nun eine für das Spenderscreening taugliche Real-time PCR zür Verfügung, so dass jederzeit ein Blutspenderscreening auf WNV eingeführt werden kann.
• The West Nile Virus (WNV) is a member of the Japanese encephalitis virus group of flaviviruses which is widespread in Africa, Asia, the Middle East, Southern and Eastern Europe. The unexpected occurrence of WNV in the United States (New York 1999) caused a large number of transfusion- and transplantation-associated WNV infections. Currently there is no evidence of the circulation of WNV in the German blood donor population. The object of this dissertation was to determine the prevalence and incidence of the WNV and then evaluate the hazard of transfusion associated WNV infections. Initially the prevalence of WNV was determined. The sensitivity and specificity of different ELISAs (Panbio, Focus and Euroimmun) for WNV antibody detection were tested. It was shown that WNV has an intense antibody cross reaction especially with the tick borne encephalitis virus, which has a high prevalence in Germany. An algorithm was developed which included TBEV-ELISA and a neutralization test as a confirmatory test. To determinate the incidence of WNV a real-time PCR (RT-PCR) based on Hadfield was developed and established. After development of this test a 95% detection rate was achieved at a level of 54 copies/ml WNV-RNA ((CI): 42:6 - 79:92 copies/ml) related to a specimen in one minipool which contained eight blood donations. In addition, the sensitivity of the automatic extraction with the chemagic Magnetic Separation Module I and the improved RT-PCR was determined. The 95% detection rate was 225 copies/ml WNV-RNA ((CI): 168:5 - 314:3 ) relating to a specimen in one minipool which contained eight blood donations. As a result of the above the manual extraction was used to determine the incidence. In addition, the commercial WNV Procleix Assay (Chiron) was used to detect all European existing strains of WNV. During the summer of 2004 the prevalence of WNV was determined. 14; 000 blood donations were collected from Hesse, Germany. Initially there appeared to be a high rate of anti-WNV reactivity of 5:9 %. But only 0:03% of this was proved at the neutralization test. 0:15% of anti-WNV positive blood donations were associated with people who had travelled into areas where WNV is endemic. The determination of incidence followed one year later. 10; 976 blood donations were collected and pooled to 1; 372 minipools and analysed by the RT-PCR. 1; 247 from the initial 1; 372 minipools were analysed with the commercial WNV Procleix Assay (Chiron). Both research methods could not detect one WNV positive blood donation. From this research WNV was not found in this relatively large number of the German blood donor population. Currently there is no hazard of transfusion-associated WNV infections in Germany. However, ’imported’ WNV infections from endemic areas were found in the sample group. With more intercontinental travel and environmental changes these could lead to the introduction of WNV to Germany. To prevent WNV infections in Germany the real-time PCR, which has been developed during this work, can be used for blood donation screening.