Open Access

Virginia Guarani-Pereira

• One of the key functions of blood vessels is to transport nutrients and oxygen to distant tissues and organs in the body. When blood supply is insufficient, new vessels form to meet the metabolic tissue demands and to re-establish cellular homeostasis. Expansion of the vascular network through sprouting angiogenesis requires the specification of ECs into leading (sprouting) tip and following (non-sprouting) stalk cells. Attracted by guidance cues tip cells dynamically extend and retract filopodia to navigate the nascent vessel sprout, whereas trailing stalk cells proliferate to form the extending vascular tube. All of these processes are under the control of environmental signals (e.g. hypoxia, metabolism) and numerous cytokines and peptide growth factors. The Dll4/Notch pathway coordinates several critical steps of angiogenic blood vessel growth. Even subtle alterations in Notch activity can profoundly influence endothelial cell behavior and blood vessel formation, yet little is known about the intrinsic regulation and dynamics of Notch signaling in endothelial cells. In addition, it remains an open question, how different growth factor signals impinging on sprouting ECs are coordinated with local environmental cues originating from nutrient-deprived, hypoxic tissue to achieve a balanced endothelial cell response. Acetylation of lysines is a critical posttranslational modification of histones, which acts as an important regulatory mechanism to control chromatin structure and gene transcription. In addition to histones, several non-histone proteins are targeted for acetylation reversible acetylation is emerging as a fundamental regulatory mechanism to control protein function, interaction and stability. Previous studies from our group identified the NAD+-dependent deacetylase SIRT1 as a key regulator of blood vessel growth controlling endothelial angiogenic responses. These studies revealed that SIRT1 is highly expressed in the vascular endothelium during blood vessel development, where it controls the angiogenic activity of endothelial cells. Moreover, in this work SIRT1 has been shown to control the activity of key regulators of cardiovascular homeostasis such as eNOS, Foxo1 and p53. The present study describes that SIRT1 antagonizes Notch signaling by deacetylating the Notch intracellular domain (NICD). We showed that loss of SIRT1 enhances DLL4-induced endothelial Notch responses as assessed by different luciferase responsive elements as well as transcriptional analysis of Notch endogenous target genes activation. Conversely, SIRT1 gain of function by overexpression of pharmacological activation decreases induction of Notch targets in response to DLL4 stimulation. We also showed that the NICD can be directly acetylated by PC AF and p300 and that SIRT1 promotes deacetylation of NICD. We have identified 14 lysines that are targeted for acetylation and their mutation abolishes the effects of SIRT1 of Notch responses. Furthermore, over-expression or activation of SIRT1 significantly reduces the levels of NICD protein. Moreover, SIRT1-mediated NICD degradation can be reversed by blockade of the proteasome suggesting a mechanism resulting from ubiquitin-mediated proteolysis. Indeed, we have shown that SIRT1 knockdown or pharmacological inhibition decreased NICD ubiquitination. We propose a novel molecular mechanism of modulation of the amplitude and duration of Notch responses in which acetylation increases NICD stability and therefore permanence at the promoters, while SIRT1, by inducing NICD degradation through its deacetylation, shortens Notch responses. In order to evaluate the physiological relevance of our findings we used different models in which the Notch functions during blood vessel formation have been extensively characterized. First, retinal angiogenesis in mice lacking SIRT1 activity shows decreased branching and reduced endothelial proliferation, similar to what happens after Notch gain of function mutations. ECs from these mice exhibit increased expression of Notch target genes. Second, these results were reproducible during intersomitic vessel growth in sirt1-deficient zebrafish. In both models, the defects could be partially rescued by inhibition of Notch activation. Third, we used an in vitro model of vessel sprouting from differentiating embryonic bodies in response to VEGF in a collagen matrix. Our results showed that Sirt1-deficient cells shows impaired sprouting which correlated with increased NICD levels. In addition, when in competition with wild-type cells in this assay, Sirt1-deficient cells are more prone to occupy the stalk cell position. Taken together, our study identifies reversible acetylation of NICD as a novel molecular mechanism to adapt the dynamics of Notch signaling and suggest that SIRT1 acts as a rheostat to fine-tune endothelial Notch responses. The NAD+-dependent feature of SIRT1 activity possibly links endothelial Notch responses to environmental cues and metabolic changes during nutrient deprivation in ischemic environments or upon other cellular stresses.
• Das Wachstum von Blutgefäßen ist entscheidend für die embryonale Entwicklung, das Wachstum des Organismus sowie die Reparatur von Gewebe während der postnatalen Entwicklung. Um sicherzustellen, dass jede Zelle während des Wachstums und der Geweberegeneration ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt wird, bildet der Organismus neue Blutgefäße, um den metabolischen Anforderungen des Gewebes gerecht zu werden. Die innerste Zellschicht der Blutgefäße, das Endothel, spielt für die Bildung und das Wachstum neuer Blutgefäße eine entscheidende Rolle - ein Prozess, der als Angiogenese bezeichnet wird. Um ein komplexes Gefäßnetzwerk ausbilden zu können, müssen Endothelzellen Aussprossung, Migration und Proliferation in einer zeitlich und örtlich geordneten Weise koordinieren. Neuere Untersuchungen konnten zeigen, dass das angiogene Wachstum neuer Gefäße eine Spezifikation der Endothelzellen in sogenannte „Tip-“ und „Stalk-Zellen“ erfordert. Tip-Zellen finden sich an der Spitze auswachsender Gefäßsproße, bilden eine Vielzahl von Filopodien und navigieren das Blutgefäßwachstum. Stalk-Zellen hingegen bilden deutlich weniger Filopodien, proliferieren, folgen den Tip-Zellen und ermöglichen so das geordnete Auswachsen der Blutgefässe. Die Notch-Signalkaskade ist ein evolutionär hoch konservierter, inter-zellulärer Kommunikationsmechanismus, der die Differenzierung verschiedener Zelltypen kontrolliert. Untersuchungen der letzten Jahre haben ergeben, dass zentrale Prozesse des Blutgefäßwachstums, wie zum Beispiel die Spezifizierung der Tip- und Stalk-Zellen entscheidend durch den Notch-Signalweg kontrolliert werden. Bereits geringste Veränderungen der endothelialen Notch-Aktivität führen zu tiefgreifenden Störungen des Endothelzellverhaltens und der Blutgefäßbildung und genetische Mutationen in Komponenten der Signalkaskade sind für eine Mehrzahl von vaskulären Pathologien verantwortlich. Trotz der Erkenntnis, dass der Notch-Signalweg eine essentielle Bedeutung für das Wachstum und die Homöostase der Blutgefäße spielt, ist über die Regulation und die Dynamik der Notch-Kaskade in Endothelzellen sehr wenig bekannt. Die Acetylierung der Aminosäure Lysin ist eine wichtige post-translationale Modifikation von Histon-Proteinen und spielt eine zentrale Rolle in der Regulation der Chromatin-Struktur sowie der transkriptionellen Genregulation. Neure Studien haben jedoch gezeigt, dass nicht nur Histon-Proteine acetyliert werden, sondern ebenfalls eine Vielzahl von nukleären und zytoplasmatischen Nicht-Histon-Proteinen, wie zum Beispiel Transkriptionsfaktoren, Co-Faktoren und Enzyme. Die reversible Acetylierung ist ein grundlegender Mechanismus über den Proteineigenschaften durch Änderung der Proteinbindung, Aktivität, Lokalisation und Stabilität auf unterschiedliche Weise beeinflusst werden können. Der Prozess der reversiblen Acetylierung ist dynamisch und wird von entgegengesetzt agierenden (Histon-) Acetyltransferasen und (Histon-) Deacetylasen kontrolliert. Die Regulation der antagonistischen Aktivitäten dieser Enzyme dient als zentraler Mechanismus die Genexpression zu balancieren sowie der Aktivität verschiedener zellulärer Signalkasaden zu steuern. Sirtuin-1 (SIRT1) ist eine NAD+-abhängige Proteindeacetylase, die der Familie der Sirtuine angehört. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe konnten bereits eine essentielle Funktion von SIRT1 in der postnatalen Angiogenese aufzeigen. Ein erster Hinweis auf eine molekulare Verbindung zwischen SIRT1 und dem Notch-Signalweg resultierte aus der experimentellen Beobachtung, dass sirt1-defiziente Zebrafische Störungen der Gefäßbildung aufwiesen, die ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit Zebrafisch-Mutanten aufweisen, die durch eine erhöhte Notch-Aktivität charakterisiert sind. Vor dem Hintergrund dieser Befunde untersuchten wir die Bedeutung der Metabolismusund Redox-sensitiven Deacetylase SIRT1 für die Regulation des endothelialen Notch-Signaling. Reportergen-Studien sowie qPCR-Analysen mit Notch-regulierten Genen zeigten, dass die gezielte Ausschaltung von SIRT1 mittels „small interfering RNA“ (siRNA) in kultivierten Endothelzellen keinen Einfluss auf basale Notch-Aktivität hatte, jedoch zu einer signifikanten Verstärkung der Notch-Aktivität nach Stimulation mit dem Notch-Liganden DLL4 führte. Im Gegensatz dazu hatte die pharmakologische Aktivierung von SIRT1 in Endothelzellen mit dem „small molecule activator“ SRT2183 eine deutliche Hemmung der DLL4-induzierten Notch-Aktivität zur Folge, so dass eine hemmende Funktion von SIRT1 in der Notch-Signalkaskade vermutet werden konnte. Dieser inhibierende Einfluß von SIRT1 auf den Notch-Signalweg war nicht durch eine verminderte mRNA Expression der Notch Rezeptoren oder anderer entscheidender Komponenten des Signalwegs bedingt (z.B. NOTCH1, NOTCH4, MAML, NCoR), da die RNA Interferenz-vermittelte Reduktion von SIRT1 keinen signifikanten Einfluss auf die basale Expression dieser Gene hatte. Stattdessen führte der siRNA-induzierte Knockdown von SIRT1 zu einer deutlich gesteigerten Notch-Aktivität, wenn die intrazelluläre Domäne des Notch1 Rezeptors (NICD) in SIRT1-defiziente Endothelzellen co-transfiziert wurde. Passend zu einem repressiven Einfluß von SIRT1 auf die Notch-Aktivität, konnte die NICD-induzierte Notch-Antwort in Endothelzellen dosisabhängig durch Überexpression von SIRT1 blockiert werden. Diese Befunde legen nahe, dass SIRT1 den Notch-Signalweg auf Ebene der NICD moduliert. Der hemmende Einfluss von SIRT1 auf die endotheliale Notch-Aktvität erforderte zudem die Deacetylase-Aktivität von SIRT1, da eine katalytisch inaktive SIRT1 Mutante keine Einfluss auf das Notch-Signaling hatte. Die Summe dieser Befunde zeigt, dass der endotheliale Notch-Signalweg nur durch SIRT1 beeinflusst wird, wenn Endothelzellen mit aktivierenden Notch-Liganden, wie zum Beispiel DLL4, angeregt werden und lässt einen post-transkriptionellen Regulationsmechanismus vermuten, der die Deacetylase-Funktion von SIRT1 erfordert. In biochemischen Analysen zeigte sich, dass der SIRT1-abhängigen Regulation des Notch-Signalwegs eine Protein-Protein-Interaktion zwischen SIRT1 und NICD zugrunde liegt, die eine unversehrte SIRT1 Deacetylase-Domäne erforderte. Interessanterweise war jedoch eine ausgeprägte Verminderung der NICD Proteinexpression zu beobachten, wenn NICD mit SIRT1 co-exprimiert wurde, ohne das Veränderungen der Notch1 mRNA Expression verzeichnet werden konnten. Auf Grundlage dieser Befunde kann spekuliert werden, dass SIRT1 die Protein-Stabilität der NICD verändert. Da die Deacetylase-Domäne von SIRT1 für die Interaktion mit NICD notwendig war, wurde weiterhin untersucht, ob NICD selbst ein acetyliertes Nicht-Histon-Protein ist. Untersuchungen mit den Notch-assozierten Acetyltransferasen p300 und PCAF ergaben, dass NICD deutlich und dosisabhängig durch sowohl p300 als auch PCAF acetyliert werden kann. In Übereinstimmung mit dem Modell einer reversiblen Acetylierung, führte die pharmakologische und genetische Hemmung der SIRT1 Aktivität zu einem deutlichen Anstieg des NICD Acetylierungsniveaus. Darüber hinaus verhinderte die Überexpression von SIRT1 die p300-vermittelte Acetylierung der NICD und konnte in einem biochemischen Deacetylierungs-Assay mit rekombinanten Proteinen die NICD direkt deacetylieren. Diese Daten illustrieren die reversible Acetylierung der NICD und identifizieren SIRT1 als bedeutsame NICD-Deacetylase. Um die acetylierten Lysinreste der NICD zu identifizieren, wurden massenspektrometrische Untersuchungen durchgeführt. Diese Untersuchungen ergaben, dass 14 hochkonservierte Lysinreste der NICD acetyliert werden können. Die Mutation dieser Lysine zu Arginin hatte eine nahezu vollständige Hemmung der NICD Acetylierung zur Folge. Darüber hinaus war diese Acetylierungs-defiziente NICD Mutante resistent gegenüber der SIRT1-vermittelten Regulation des Notch-Signalwegs. Diese Beobachtungen unterstreichen die molekulare Bedeutung der NICD Acetylierung und lassen vermuten, dass eine Reihe von Lysin-Aminosäuren der NICD für die negative Regulation der Notch-Kaskade durch SIRT1 erforderlich ist. Da bekannt ist, dass NICD ein kurzlebiges Protein ist, welches durch eine Ubiquitinvermittelte Degradation abgebaut wird und Acetylierung von Lysinen die Ubiquitinierung von Proteinen beeinträchtigen kann, wurde die Auswirkungen von SIRT1 auf den Ubiquitinabhängigen Abbau des NICD Proteins untersucht. In Übereinstimmung mit vorhergehenden Analysen, wurde eine starke Ubiquitinierung der NICD bereits unter Kontrollbedingungen beobachtet. Die Hemmung der SIRT1 Aktivität durch den pharmakologischen Sirtuin-Inhibitor Nicotinamid (NAM) oder durch RNA Interferenz resultierte jedoch in einer deutlich verminderten Ubiquitinierung der NICD, was darauf hindeutet, dass SIRT1 die Ubiquitinierung der NICD beeinflusst. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen daher, dass NICD ein acetyliertes Protein ist und, dass die NICD-Acetylierung die Signalamplitude und Dauer der Notch-Antworten durch Veränderung des NICD Proteinumsatz steuert. SIRT1 wiederum agiert als NICD-Deacetylase, die der Acetylierungsinduzierten Proteinstabilisierung der NICD entgegenwirkt, um die Signalstärke und Dauer der Notch-Antwort zu limitieren. Um festzustellen, ob dieser neue molekulare Mechanismus der Notch-Regulation durch SIRT1 auch in vivo von physiologischer Bedeutung ist, wurde die katalytische Domäne von Sirt1 spezifisch in Endothelzellen durch eine Cre / loxP-vermittelte Exzision inaktiviert und die postnatale Gefäßneubildung in der Retina als etabliertes Modell-System des Dll4/Notch-Signalwegs untersucht. Immunfluoreszenzfärbungen demonstrierten, dass die Sirt1 Proteinexpression besonders ausgeprägt im Bereich der angiogenen Front des Gefäßsystems ist. Interessanterweise war die Sirt1 Expression vor allem Stalk-Zellen prominent. Im Vergleich zu Kontroll-Mäusen fand sich in endothel-spezifischen Sirt1 Mutantenmäusen eine deutlich verzögerte Expansion des Gefäßplexus sowie eine signifikante Reduktion der Gefäßdichte und der Endothelproliferation. Diese strukturellen Veränderungen des sich entwickelnden Gefäßnetzwerks der Retina weißt verblüffende Ähnlichkeit mit der defekten Gefäßbildung in Mausmutanten auf, die durch eine erhöhte Notch-Aktivität in endothelialen Stalk-Zellen bedingt sind. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wiesen aus Sirt1-defizienten Mäusen gewonnene Endothelzellen eine deutlich gesteigerte Expression verschiedener direkter Notch-Zielgene nach Stimulation mit DLL4 auf. Diese Daten suggerieren, dass SIRT1 als bedeutsamer negativer Modulator des Notch-Signalwegs während der Angiogenese fungiert, dessen Ausschaltung zu einer deutlich gesteigerten Notch-Aktivität führt sowie einem gestörten Gefäßwachstum führt. Um zu untersuchen, ob eine Hemmung des Notch-Pathway die gestörte Gefäßneubildung in den endothel-spezifischen Sirt1 Mutantenmäuse aufheben kann, wurden diese Tiere mit dem pharmakologischen Notch Inhibitor DAPT behandelt. Wie in vorherigen Studien berichtet, induzierte die Behandlung von Kontrolltieren mit DAPT ein stark verdichtetes, übermäßig verzweigtes sowie unkoordiniert auswachsendes Blutgefäßnetzwerk. Nach Behandlung mit DAPT entwickelten die Sirt1 Mutanten ein mit den Kontroll-Mäusen vergleichbares Ausmaß der Gefäßdichte und Gefäßverzweigung. Diese Befunde deuteten darauf hin, dass die Reduktion der Gefäßdichte sowie die verminderte Komplexität des Gefäßplexus in den Sirt1- defizienten Mäusen Folge einer erhöhten Notch-Aktivität ist. In Analogie zu diesen Befunden rief sowohl der Knockdown der sirt1 Expression mittels spezifisch gegen sirt1 gerichteten Antisense-Morpholino-modifizierten Oligonukleotiden als auch die endothel-spezifische Expression einer dominant negativen SIRT1 Mutante Defekte in der Intersegmentalgefäßbildung des Zebrafisch hervor, die stark an Notch-induzierte Fehlbildungen im Zebrafisch erinnerten. Diese Störung der Gefäßentwicklung in sirt1- defizienten Zebrafischen gingen in der Tat mit einer vermehrten Notch-Aktivität in den Gefäßen des Zebrafish einher. So führte der Morpholino-induzierte Knockdown von sirt1 zu einer signifikant gesteigerten GFP Expression in Embryonen der transgenen Notch-Reporterlinie Tg(tp1bglob:EGFP), die indikativ für erhöhte Notch-Aktivität in dieser transgenen Linie ist. Weiterhin konnte die gestörte Gefäßentwicklung in den sirt1-defizienten Zebrafischen durch Behandlung mit dem γ-Sekretase-Inhibitor DAPT oder durch Knockdown des arterien-spezifischen Notch-Liganden dll4 zu einem wesentlichen Anteil normalisiert werden. Diese Befunde legen nahe, dass eine Fehlregulation der endothelialen Notch-Aktivität eine zentrale Ursache für die strukturellen Gefäßdefekte der sirt1-defizienten Zebrafische ist. Zur weiteren Beurteilung der Auswirkungen von SIRT1 auf Notchkontrollierte Endothelfunktionen wurde die endotheliale Ausprossung und Proliferation untersucht in vitro untersucht. Kontroll-Endothelzellen bildeten kapillar-ähnliche Aussprossungen in einer dreidimensionalen Kollagen-Matrix. Im Gegensatz dazu führte die siRNA-vermittelte Reduktion der SIRT1 Expression zu einer deutlichen Hemmung der Aussprossungen, mit Verminderung der Anzahl und Länge der Endothelsprossen. Dieses gestörte Aussprossungsverhalten der SIRT1-defizienten Endothelzellen konnte durch gleichzeitige Behandlung mit dem pharmakologischen Notch Inhibitor DBZ aufgehoben werden. In gleicher Weise wurde die DLL4-induzierte Hemmung der endothelialen Proliferation durch Ausschaltung von SIRT1 verstärkt, und durch Notch-Hemmung wiederhergestellt. Um schließlich zu untersuchen, ob SIRT1 zell-autonom Notch-Antworten in Endothelzellen moduliert, wurde ein in vitro Model verwendet, in dem differenzierende embryonale Stammzellen der Maus (Embryoid Bodies, EBs) hierarchisch angeordnete Gefäßnetze nach Stimulation mit VEGF in einer DLL4/Notch-abhängingen Weise ausbilden. Kontroll-EBs entwickelten komplexe und hoch verzweigte Gefäßnetze. Die Inaktivierung von Sirt1 durch genetische Deletion der katalytischen Domäne resultierte in einem stark reduzierten Wachstum von Gefäß-artigen Strukturen und verminderte die Gefäßdichte. In chimären EBs, die aus einer 1:1-Mischung von Sirt1 Wildtyp und Sirt1 mutierten Zellen bestanden, konnte eine partielle Wiederherstellung der angiogenen Aktivität erzielt werden. In Übereinstimmung mit der Modellvorstellung, das eine Sirt1-Defizienz zu einer Sensitivierung gegenüber DLL4/Notch Signalen führt, fand sich in Sirt1 mutierten Zellen eine signifikant erhöhte Proteinexpression der NICD. Dieses erhöhte Expressionsniveau der NICD in Sirt1-defizienten Zellen war ebenfalls mit einer vornehmlichen Anordnung dieser Zellen in der „Stalk“-Position der neugebildeten Gefäße assoziiert. Aus diesen Resultaten schließen wir, dass SIRT1 als zell-autonomer negativer Modulator des Notch-Signalwegs in Endothelzellen agiert. Diese Studien etablieren daher eine zuvor unbekannte regulatorische Rolle von SIRT1 in der Notch-Signalkaskade und identifizieren die reversible Acetylierung der NICD als einen zentralen molekularen Mechanismus, die Dynamik der Notch-Aktivität zu kontrollieren.