Open Access

Caroline Bier

• Krebs stellt die zweithäufigste Todesursache in Europa dar. Obwohl sich Diagnose und Heilungschancen über die letzten Jahre verbessert haben, besteht bei bestimmten neoplastischen Erkrankungen eine unverändert schlechte Prognose. Grundlage für eine langfristige Verbesserung des Behandlungserfolges ist ein molekulares Verständnis der Mechanismen, welche zur Krankheitsentstehung, Progression und Therapieresistenz beitragen. Nur so ist es möglich, nach neuen pharmakologischen und oder/genetischen Inhibitoren zu suchen, welche spezifische Eigenschaften dieser Faktoren blockieren und somit die Entwicklung neuer Therapiestrategien erlauben („from bench to bedside“). In diesem Zusammenhang spielen Proteasen nicht nur eine wichtige Rolle in pathobiologischen Prozessen, sondern stellen auch klinisch anerkannte Zielstrukturen derzeitiger Behandlungsstrategien dar. So wurde auch die Threonin-Protease Taspase1 als potenzielles Therapieziel der von Mixed Lineage Leukemia (MLL)-Translokationen verursachten Leukämien postuliert. Die Taspase1-induzierte Spaltung des MLL Proteins spielt eine wichtige physiologische Rolle in Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen. Darüber hinaus scheint Taspase1 durch die Prozessierung von MLL-Translokationsprodukten, im speziellen des Produkts der t(4;11), maßgeblich zur Leukämieentstehung beizutragen. Zusätzlich gibt es, wie auch in dieser Arbeit gezeigt, erste Hinweise, dass Taspase1 auch für solide Tumore bedeutsam sein könnte. Jedoch sind unsere Kenntnisse über die molekularen Mechanismen, welche für die (patho)biologischen Funktionen von Taspase1 verantwortlich sind, bislang noch lückenhaft. Obwohl neben MLL-Proteinen einige wenige Taspase1-Zielproteine postuliert wurden, fehlt derzeit eine Übersicht über das „Taspase1-Degradom“. Die Kenntnis aller humanen Taspase1-Zielproteine stellt eine wichtige Voraussetzung dar, um die biologischen Funktionen dieser Typ2-Asparaginase gezielter erforschen und verstehen zu können. Zudem stehen im Gegensatz zu anderen Proteasen für Taspase1 bislang keine wirksamen Inhibitoren zur Verfügung, welche nicht nur als potenzielle Wirkstoffe, sondern vor allem als „chemische Werkzeuge“ der Funktionsaufklärung dienen könnten. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das erste effiziente zellbasierte Taspase1- Testsystem entwickelt. Das Translokations-Testsystem basiert auf einem autofluoreszierenden Indikatorprotein, welches eine Taspase1-Spaltstelle enthält und durch die Wahl geeigneter Transportsignale zwischen Kern und Zytoplasma wandert. Nach Koexpression aktiver Taspase1, nicht aber inaktiver Taspase1-Mutanten bzw. anderer Proteasen, wird dieser Biosensor gezielt gespalten und dessen Akkumulation im Zellkern induziert. Die Spezifität des Testsystems mit seinem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erlaubte dessen Anpassung an eine Mikroskopie-basierte Hochdurchsatz-Plattform (Knauer et al., PloS ONE eingereicht). Durch gerichtete Mutagenese der Taspase1-Spaltstelle im Biosensor-Kontext konnte eine optimierte Konsensus-Erkennungssequenz für Taspase1 (Aminosäuren Q3[F,I,L,V]2D1¯G1’X2’D3’D4’) definiert werden, welche erstmalig eine zuverlässige bioinformatische Vorhersage des humanen Taspase1-Degradoms erlaubte. Die biologische Relevanz dieser Analyse wurde durch Validierung einzelner Zielproteine unterstrichen, wobei bisher noch nicht beschriebene Taspase1-Zielproteine wie beispielsweise Myosin1F und der Upstream Stimulating Factor 2 identifiziert wurden. Obwohl für beide Proteine bereits eine tumor-assoziierte Funktion beschrieben ist, bleibt die kausale Rolle von Taspase1 für deren (patho)physiologische Funktionen noch zu klären (Bier et al., JBC). Die Tatsache, dass Taspase1 als nukleäres/nukleoläres Protein identifiziert werden konnte, es sich bei den vorhergesagten Zielproteinen jedoch nicht ausschließlich um Kernproteine handelt, belegte die Notwendigkeit, die Regulation der intrazellulären Lokalisation von Taspase1 zu entschlüsseln. Experimentelle und bioinformatische Analysen zeigten erstmalig, dass Taspase1 über ein zweigeteiltes Importsignal über Importin-a aktiv in den Kern transportiert wird, jedoch kein nukleäres Exportsignal besitzt. Interessanterweise ist sowohl die cis- als auch die trans-Aktivität von diesem Kerntransport abhängig. Die nukleoläre Akkumulation wird hingegen durch die Wechselwirkung mit Nukleophosmin vermittelt. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass Taspase1 am Nukleolus aktiviert wird und möglicherweise durch die Kernexportfunktion von Nukleophosmin transient Zugang zum Zytoplasma erhält, um so auch zytoplasmatische Proteine zu prozessieren (Bier et al., Traffic eingereicht). Zusätzlich konnten erstmalig multiple post-translationale Modifikationen von Taspase1 nachgewiesen werden (Bier et al., Manuskript in Vorbereitung). So kann Taspase1 über die Interaktion mit den Peptidasen Senp1-3 sowohl durch Sumo1 als auch durch Sumo2 sumoyliert werden. Diese so vermittelten dynamischen (De)Sumoylierungszyklen könnten eine Feinregulation der Enzym-Substrat-Interaktion darstellen. Zusätzlich wird Taspase1 durch verschiedene Histon-Acetyltransferasen (HAT) acetyliert und dadurch möglicherweise in seiner enzymatischen Aktivität beeinflusst. Interessanterweise acetylieren die HATs p300 und GCN5 hauptsächlich die Proform von Taspase1, was mit einer verstärkten cis-Aktivität einhergeht, während CBP und pCAF eher die prozessierte Form acetylieren. Andererseits interagieren die Histon-Deacetylasen HDAC-3 und -6 mit Taspase1, was nur die cis-Aktivität zu beeinflussen scheint. HDAC1 hingegen verhindert die Prozessierung der zweiten MLL-Schnittstelle, was auf eine zyklische Regulation im Wechsel mit der Acetylierung schließen lässt. WeitereUntersuchungen müssen klären, ob und wie diese post-translationale Feinregulation die (patho)biologische Aktivität von Taspase1 beeinflussen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit entscheidende neue Einblicke in die biologische Funktion und Regulation von Taspase1 gewonnen werden.
• Cancer represents the second leading cause of death in Europe. Although diagnosis and prognosis have improved in recent years, there are certain neoplastic diseases with an unchanged poor prognosis. Basis for long-term improvement of treatment success is an understanding of the molecular mechanisms that contribute to disease development, progression and treatment resistance. Only then it is possible to search for new pharmacological and/or genetic inhibitors that block specific properties of these factors and thus allow the development of new therapeutic strategies ("from bench to bedside"). In this context, proteases not only play an important role in the pathobiological processes, but are also clinically recognized targets of current treatment strategies. Thus, the threonine protease Taspase1 causing leukemia by Mixed Lineage Leukemia (MLL) translocations was postulates as a potential therapeutic target. The Taspase1-induced cleavage of the MLL protein plays an important physiological role in developmental and differentiation processes. In addition Taspase1 seems to contribute significantly to leukemia through the processing of MLL translocation, especially of the product of the t(4, 11). In addition, there is, as also shown in this work, first evidence that Taspase1 could also be important for solid tumors. However, our knowledge about the molecular mechanisms those are responsible for the (patho)biological functions of Taspase1, is still incomplete. Although there are a few other targets postulated besides MLL proteins, but an overview of the "Taspase1-Degradom” is still missing. The knowledge of all human Taspase1 target proteins is an important prerequisite for analyzing and understanding the biological functions of this type 2 asparaginase. In contrast to other proteases there are no effective inhibitors for Taspase1 available, which may not only serve as potential drugs, but also as chemical tools to explore its function. Therefore, we developed in the present study the first efficient cell-based Taspase1 assay system. The translocation assay based on an indicator autofluorescent protein that contains a Taspase1 cleavage site and travels between the nucleus and cytoplasm through a selection of appropriate transport signals. After co-expression of active Taspase1, but not inactive Taspase1 mutants or other proteases, this biosensor is cleaved specifically and accumulates in the nucleus. The specificity of the test system with its high signal-to-noise ratio allowed adaptation to a microscopy-based high-throughput platform. Through site directed mutagenesis in the context of the biosensor we were able to define the optimized Taspase1 consensus sequence (Q3[F, I, L, V]2D1¯G1'X2'D3'D4') which for the first time allows a reliable bioinformatic prediction of the human-Taspase1 degradom. The biological relevance of this analysis was highlighted by validation of individual target proteins, which were not previously described Taspase1 target proteins such as Myosin1F and the upstream stimulating factor 2. Although for both proteins already a tumor-associated function was described, it needs to be clarified what impact processing through Taspase1 has on their (patho)physiological functions. The fact that Taspase1 was identified as a nuclear/nucleolar protein, while in contrast not all predicted target proteins are solely nuclear documents the necessity to analyze the regulation of Taspase1 intracellular localization. Experimental and bioinformatic analysis revealed for the first time that Taspase1 is actively transported into the nucleus via interaction with importin-α through is bipartite NLS. Interestingly, both the cis and trans activity of Taspase1 dependents on this nuclear transport. Initial results suggest that Taspase1 is activated at the nucleolus, and possibly gains transient access to the cytoplasm by the interaction with nucleophosmin in order to process the cytoplasmic proteins. In addition, we were the first to detect multiple post-translational modifications of Taspase1. Taspase1 might be sumoylated by the interaction with the peptidases SENP1-3 by both SUMO1 and SUMO2. This conveyed dynamic (de)sumoylation could be a fine regulation of the enzyme-substrate interaction. In addition Taspase1 is acetylated by various histone acetyltransferases (HAT) and therefore may be influenced in its enzymatic activity. Interestingly, the HATs p300 and GCN5 acetylate mainly the proenzyme of Taspase1, which is associated with increased cis-activity, while CBP and PCAF acetylate the processed form. On the other hand, interaction of histone deacetylases HDAC-3 and -6 with Taspase1, seem to affect only the cis-activity. HDAC1, however prevented the processing of the second MLL interface, suggesting a cyclical regulation, alternating with the acetylation. In conclusion, in this work could provide crucial new insights into the biological function and regulation of from Taspase1.