Open Access

Nina Gildenhoff

• The aim of this thesis was to elucidate the excitation energy transfer in the fucoxanthin-chlorophyll proteins (FCPs) isolated from the diatom Cyclotella meneghiniana in detail and to clarify the role of the different pigments contained. In a first step the excited state dynamics of the free pigments were studied by means of time-resolved absorption spectroscopy. The FCPs contain three different carotenoid species. Besides the main light-harvesting carotenoid fucoxanthin (fx) the xanthophyll cycle pigments diadinoxanthin (ddx) and diatoxanthin (dtx) are found in substoichiometric amounts. Fx is contained in an unusual carotenoid-to-chlorophyll ratio of about one. In case of ddx and dtx, changing the solvent polarity showed no significant effects on the absorption spectrum and the excited state dynamics were hardly influenced. In contrast, a solvent dependence is observed in the absorption spectrum and excited state dynamics of fx. The S1 lifetime depends strongly on the solvent polarity and an additional broad excited state absorption band red shifted compared to the S1 excited state absorption appears. The occurrence of the described features can be explained with an intramolecular charge transfer state, which is stabilized in a polar environment and appears only in carotenoids with a conjugated carbonyl group. Despite its rather short excited state lifetimes of less than 200 fs (S2) and 30-60 ps (S1), fx acts as a very efficient energy donor in the FCPs. The ultrafast energy transfer dynamics of the isolated proteins FCPa and FCPb were investigated in a comprehensive study using transient absorption in the visible and NIR spectral region complemented with polarized transient absorption spectroscopy. The excitation energy transfer was not influenced significantly by changing the light conditions during the growth, which yields an altered amount of ddx and dtx. It can be concluded that the contribution of the xanthophyll cycle pigments to the energy transfer is not significant. The altered oligomerization state results in a more efficient energy transfer for the trimeric FCPa, which is also reflected in different Chl a fluorescence quantum yields. Thus, an increased quenching in the higher oligomers of FCPb can be assumed. The observed dynamics change drastically for two different excitation wavelengths λ = 500 nm and λ = 550 nm, which both lead to the population of the S2 excited state of individual carotenoids, namely blue and red absorbing fx molecules. The differing absorption maxima result from distinct microenvironments within the protein. For FCPa an additional slow time constant of 25 ps was found after excitation at 500 nm. By means of polarized transient absorption spectroscopy applied to FCPa different transition dipole moments for the S1 and the ICT state of fx could be identified. Based on the presented studies a detailed model explaining the excitation energy transfer pathways could be developed. In agreement with the faster overall transfer rate which is also evident in the anisotropy data in case of 550 nm excitation, upon excitation at 500 nm one slow transfer channel is active. It can be attributed to a blue absorbing fx not strongly associated with a Chl a molecule. Most likely excitation energy transfer takes place between the S1/ICT states of two different fx molecules before the energy is transferred to Chl a. Additional transient absorption experiments with an improved time resolution were performed to investigate the oscillations observed. These coherent effects superimposed the kinetics of isolated carotenoids as well as FCPs within the first 500 fs. The oscillations showed a very unusual damping behavior and vanished already after two oscillation periods. In case of fx, the solvent environment as well as the excitation wavelengths had an influence on the oscillations. The frequencies of the oscillations were 70-100 cm^-1 for fx in solvents with varying polarity and 50-80 cm^-1 for the FCPs. These results could further confirm the assumption that the red absorbing fx molecules are located in a more polar environment within the protein compared to the blue absorbing fx. To clarify the origin of the oscillations in more detail, further experiments with a controlled chirp of the applied pulses and comparison between different carotenoids in various solvents are required. This approach promises to give further insight in the excited state dynamics and to answer the question whether dark states are involved. Right now, the coherent excitation of the strongly coupled excited states 1Bu+ (S2) and 1Bu- resulting in electronic quantum beats and the existence of an additional short lived excited state absorption (S2-SN2) in the visible spectral region are the most reasonable explanations for the occurrence of the coherent effects in the transient absorption spectra of carotenoids.
• Ziel der vorliegenden Arbeit war die detaillierte Untersuchung des ultraschnellen Energietransfers (50 fs – 100 ps) in den Fucoxanthin-Chlorophyll-Proteinen (FCPs) aus der Kieselalge Cyclotella meneghiniana. Obwohl ihre Lichtsammelkomplexe den LHCII-Komplexen höherer Pflanzen ähneln, beinhalten sie andere Pigmente in einer ungewöhnlichen Zusammensetzung. Neben dem wichtigsten akzessorischen Pigment Fucoxanthin (Fx) finden sich Diadinoxanthin (Ddx) und Diatoxanthin Dtx) in substöchiometrischen Mengen. Dagegen ist Fx in einem ungewöhnlich hohen Carotinoid-zu-Chlorophyll-Verhältnis von etwa eins enthalten. Fx besitzt eine Carbonylgruppe, welche mit dem pi-Elektronensystem der Kohlenstoffkette konjugiert ist. Mittels transienter Absorptionsspektroskopie wurde der Energietransfer in FCPa und FCPb, die sich durch ihren Oligomerisierungszustand unterscheiden, sowie die Dynamik der isolierten Carotinoide detailliert untersucht. Im Gegensatz zu Ddx und Dtx veränderten sich das Absorptionsspektrum und vor allem die Dynamik des Fx in Lösungsmitteln mit unterschiedlichen Polaritäten. Die beobachteten Effekte können mit intramolekularen Ladungstransferzuständen erklärt werden, welche auch in anderen Carotinoiden mit einer konjugierten Carbonylgruppe auftreten und in polaren und vor allem protischen Lösungsmitteln stabilisiert werden. Trotz der sehr kurzen Lebensdauern der angeregten Zustände (t(S2) < 200 fs, t(S1) = 20-60 ps) ist Fx aufgrund seiner Nähe zu den Chl-Molekülen innerhalb der Lichtsammelkomplexe ein sehr effektiver Energiedonor. Der Vergleich der beiden Oligomere FCPa und FCPb zeigte einen effizienteren Energietransfer im trimeren FCPa, was wiederum auf ein erhöhtes Quenchen im höher oligomeren FCPb schließen lässt. Die untersuchte Dynamik ändert sich deutlich nach der Anregung der Carotinoide mit zwei verschiedenen Wellenlängen (500 nm und 550 nm). Für FCPa wurde eine zusätzliche Lebensdauer von 25 ps nach der Anregung bei 500 nm gefunden, wohingegen die Transferprozesse nach Anregung bei 550 nm nach wenigen Pikosekunden abgeschlossen sind. Zur genaueren Charakterisierung wurde FCPa in zusätzlichen Polarisations-abhängigen, transienten Absorptionsexperimenten untersucht. Für den ersten angeregten Zustand und den zugehörigen Ladungstransferzustand wurden unterschiedliche Übergangsdipolmomente gefunden. Des Weiteren ergaben sich unterschiedliche Übergangsdipolmomente für die beiden Anregungswellenlängen. Basierend auf den in der Arbeit vorgestellten Ergebnissen wurde ein detailliertes Modell zur Erklärung des Energietransfers in FCPs aufgestellt. Dabei kann angenommen werden, dass ein rot-absorbierendes Fx die absorbierte Energie effizient und direkt an ein Chl a-Molekül weitergibt. Zwei der drei verbleibenden Fx-Moleküle mit einem Absorptionsmaximum um 500 nm scheinen ebenso ihre Anregungsenergie direkt an Chl a zu transferieren. In Übereinstimmung mit der schnelleren Dynamik nach Anregung bei 550 nm, die auch in den Anisotropiedaten gefunden wurde, ist nach Anregung bei 500 nm ein zusätzlicher, langsamerer Transferpfad (25 ps) aktiv. Dieser kann demnach einem blau-absorbierenden Fx zugeordnet werden, welches weniger stark mit den Chl a-Molekülen assoziiert ist als die anderen Fx-Moleküle. Zusätzliche zeitaufgelöste Absorptionsexperimente mit verbesserter Zeitauflösung wurden durchgeführt um die oszillatorischen Effekte, die in den meisten Daten zu sehen waren, näher zu untersuchen. Diese kohärenten Effekte überlagern die Dynamiken sowohl der isolierten Carotinoide als auch der FCPs innerhalb der ersten 500 fs. Die Oszillationen zeigten ein ungewöhnliches Dämpfungsverhalten, da sie schon nach zwei Oszillationsperioden verschwinden. Zur Analyse wurden die Frequenzen der Oszillationen bestimmt, was für Fx in Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität zu Werten zwischen 70-100 cm^-1 führte. Für die FCPs variierte die Frequenz zwischen 50-80 cm^-1 in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge. Diese Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich rot-absorbierendes Fx in einer polareren Umgebung befindet als blau-absorbierendes Fx. Um den Ursprung der Oszillation noch genauer aufzuklären sind weitere Experimente mit einem kontrollierten Chirp der verwendeten Pulse und Vergleiche zwischen verschiedenen Carotinoiden in unterschiedlichen Lösungsmitteln notwendig. Weiterführende Ergebnisse sollten helfen, die Dynamik und vor allem die Beteiligung so genannter "dunkler Zustände" noch besser zu verstehen. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die in der Literatur diskutierte kohärente Anregung der stark gekoppelten, angeregten Zustände 1Bu+ (S2) und 1Bu-, welche zu elektronischen Quantumbeats führt, oder auch eine zusätzliche, extrem kurzlebige Absorption aus dem S2-Zustand in einen SN2-Zustand im sichtbaren Spektralbereich eine plausible Erklärung für das Auftreten der kohärenten Effekte in transienten Absorptionsspektren von Carotinoiden.