Open Access

Iva Nikolic

• Blood vessel formation is a well orchestrated process where multiple components including different cells types, growth factors as well as extracellular matrix proteins act in synergistic and highly regulated manner to support the growth of new blood vessels. During embryonic development this process is marked as vasculogenesis and entails the differentiation of mesodermal cells into angioblasts and their subsequent fusion into a primitive vascular plexus. Angiogenesis, in contrast, describes the formation of new vessels from the pre-existing vasculature and it occurs in the embryo during remodeling of the primitive plexus into a mature vascular network. Furthermore, in the adult, angiogenic processes play a role in various physiological and pathological conditions. Angiogenesis is governed by a set of factors and molecular mechanisms whose identification has been a major focus of cardiovascular research for the past several decades. Most recently, Epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7) has been described as a novel molecular player in this context. This secreted protein is produced by endothelial cells and has been implicated in vessel development. Studies performed in zebrafish revealed an important role for EGFL7 in lumen formation during vasculogenesis although the underlying molecular mechanism has not been elucidated yet. In contrast, the investigation of EGFL7’s functions during angiogenic sprouting has faced several challenges and the role of EGFL7 in angiogenesis remained elusive. The purpose of this thesis was to identify the functions of EGFL7 during angiogenic mode of vessel formation in a systematic fashion using numerous in vitro as well as in vivo approaches. Previously it has been suggested that EGFL7 might associate with the extracellular matrix from where it could exert its effects. Indeed, we could show that EGFL7 accumulates on the outer surface of endothelial cells in vivo by demonstrating its co-localization with collagen IV, a major constituent of the basal lamina. Furthermore, after its secretion to the extracellular matrix (ECM), EGFL7 seemed to interact with some components of the extracellular matrix including fibronectin and vitronectin, but not collagens and laminin. A major group of receptors that mediate the interaction between the cells and the ECM are integrin receptors. Our co-immunoprecipitation studies revealed that EGFL7 associated with integrin αvβ3 which is highly expressed in endothelial cells and known to be important for vessel growth. Importantly, this EGFL7-αvβ3 integrin interaction was dependent on Arg-Gly-Asp (RGD) motif present within the second EGF-like domain of EGFL7 protein. Adhesion assays performed with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) revealed that EGFL7 promoted endothelial cell adhesion compared to BSA used as a negative control, however, adhesion seemed to be less efficient as compared to bona fide ECM proteins such as fibronectin and vitronectin. In addition, cultivation of endothelial cells on EGFL7 was characterized by the absence of mature focal adhesions and stress fibers, but was paralleled by increased phosphorylation of kinases typical for integrin activation signaling cascade such as FAK, Src and Akt. This led us to the hypothesis that EGFL7 creates an environment that supports a motile phenotype of endothelial cells by serving as a modulator of existing interactions between the cells and the surrounding matrix. Indeed, EGFL7 increased random migration of HUVEC on fibronectin in an αvβ3 integrin dependent manner as shown using a live cell imaging platform. Most importantly, this was paralleled by a decrease in endothelial cell adhesion to fibronectin which is consistent with previous reports on secreted proteins that support a medium strength of adhesion and such promote cellular migration. To assess the overall effect of EGFL7 on the process of blood formation several in vitro and in vivo approaches were employed. First, the addition of EGFL7 to Matrigel injected subcutaneously into mice significantly increased the invasion of endothelial cells into the plugs. Second, a spheroid-based sprouting assay in three-dimensional collagen matrix clearly demonstrated the ability of EGFL7 to support angiogenic sprouting in an integrin dependent manner. This is consistent with the observed effects of EGFL7 on endothelial cell migration. Third, using in vivo assays such as the chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as well as a zebrafish model system we were able to validate the importance of the EGFL7-integrin interaction for the process of angiogenesis in vivo. Taken together, I identified some of the major cellular functions EGFL7 modulates during angiogenesis. In addition, with integrin αvβ3 I unraveled a novel interaction partner of EGFL7 that delivers a mechanistical explanation for EGFL7’s effects on blood vessel formation. Most importantly, data presented in this PhD thesis contribute substantially to the existing literature on EGFL7 unambiguously assigning a role for this protein in the process of angiogenesis.
• Die Bildung von Blutgefäßen ist ein fein abgestimmter Prozess, bei dem das Wachstum von neuen Gefäßen von verschiedenen Komponenten, wie z.B. unterschiedlichen Zelltypen, Wachstumsfaktoren so wie auch extrazellulären Matrixproteinen reguliert wird. Während der Embryonalentwicklung bezeichnet man diesen Prozess als Vaskulogenese, welche die Differenzierung von mesodermalen Zellen in den Angioblasten sowie ihre nachfolgende Fusion in einen primitiven vaskulären Plexus umfasst. Im Gegensatz dazu beschreibt die Angiogenese die Bildung von neuen Gefäßen ausgehend von einer bereits bestehenden Gefäßstruktur. Angiogenese findet im Embryo während der Umbildung des primitiven Plexus in ein reifes vaskuläres Netzwerk und im Erwachsenen während zahlreicher physiologischer und pathophysiologischer Prozesse. Dies betrifft verschiedene Krankheitsbilder, die durch unzureichende Blutversorgung gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel Gewebs-Ischämie, aber auch abnormes und unkontrolliertes Wachstum von neuen Gefäßen in soliden Tumoren. Auch wenn diese Prozesse sehr unterschiedlich sind, so haben sie dennoch grundlegende Faktoren und molekulare Mechanismen gemeinsam, deren Identifikation ein Kernbestandteil der kardiovaskulären Forschung in den vergangenen Jahrzehnten darstellte. Bei dem Protein „Epidermal growth factor-like domain 7“ (EGFL7) handelt es sich um einen kürzlich identifizierten, molekularen Faktor, der von Endothelzellen produziert wird und für das Gefäßwachstum von Bedeutung ist. Untersuchungen im Zebrafisch belegten eine wichtige Rolle für dieses Protein in der Lumen-Bildung während der Vaskulogenese, wenngleich der zu Grunde liegende Mechanismus noch nicht aufgedeckt werden konnte. Im Gegensatz dazu ist die Analyse der Funktion von EGFL7 in der Angiogenese eng mit der Entdeckung von miR-126/126* innerhalb des egfl7 Gens und ihrer Beteiligung an der Kontrolle von zahlreichen Aspekten der Blutgefäßbildung verknüpft. Aus diesem Grund ist es nicht möglich, die Funktion des EGFL7 Proteins mit Hilfe einer klassischen genetischen Deletion zu analysieren, so dass seine Bedeutung für angiogene Prozesse bisher nicht vollständig geklärt werden konnte. Das Ziel dieser Arbeit bestand daher darin, die Funktion von EGFL7 in der angiogenen Gefäßbildung systematisch mit einer Vielzahl von in vitro und in vivo Techniken zu untersuchen. Es wurde bereits vermutet, dass EGFL7 mit der extrazellulären Matrix (EZM) assoziiert sein und dort seine Funktion ausüben könnte. In der Tat resultierte die Kultivierung von „human umbilical vein endothelial cells” (humanen venösen Nabelschnurendothelzellen - HUVEC) auf Fibronektin in der Akkumulation von EGFL7 innerhalb der extrazellulären Matrix. Zudem konnten wir EGFL7 in menschlichem fetalen, venösen Gefäßen nachweisen, wo es hauptsächlich außerhalb der Endothelzellen vorzufinden war und mit Kollagen IV, einem Hauptbestandteil der Basallamina, ko-lokalisierte. Zusätzlich interagierte EGFL7 stark mit den extrazellularen Matrixproteinen Fibronektin und Vitronektin, aber nicht mit den strukturellen Komponenten der EZM, wie Kollagen und Laminin. Interessanterweise stellen sowohl Fibronektin als auch Vitronektin einen Hauptbestandteil der provisorischen extrazellulären Matrix dar, die abgebaut wird, sobald das vaskuläre Netzwerk seinen Ruhezustand erreicht hat. Fibronektin und Vitronektin werden während des aktiven vaskulären Wachstums sezerniert und liefern die notwendigen Signale für Endothelzellen während der Angiogenese. Insgesamt könnte dies bedeuten, dass EGFL7, sobald es vom aktivierten Endothel sezerniert wird, in die transiente Matrix inkorporiert wird und auf diese Weise direkt zelluläre Prozesse moduliert, die für das Blutgefäßwachstum von Bedeutung sind. Integrin-Rezeptoren stellen eine Hauptgruppe von Transmembran-Proteinen dar, welche die Interaktion zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix vermitteln. Da Endothelzellen leicht an EGFL7 beschichtete Platten anhaften, führten wir Adhäsionsversuche in der Gegenwart und Abwesenheit von Antikörpern...