Open Access

Silke Essler

• Hypoxie und Stickstoffmonoxid (NO) sind wichtige Mediatoren von akuten und chronischen Erkrankungen sowie auch von Tumoren. Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Eliminierung von Pathogenen aber auch bei der Induktion, Entwicklung und Metastasierung von Tumoren. Wenn Makrophagen in verletztes Gewebe, einen Entzündungsherd oder in einen Tumor einwandern, sind sie einem Umfeld ausgesetzt, das durch Hypoxie und die Produktion von NO und ROS erheblichen Stress auf die Zellen ausübt. Dieser Zellstress wirkt sich auf das Redoxgleichgewicht und damit auf die Signaltransduktion der Zellen aus. Im ersten Teil meiner Arbeit wurde mittels einer Micoarray-Analyse die Interaktion von hypoxischen und NO-vermittelten Signalen in Makrophagen und deren Bedeutung für die Zellen im entzündlichen Umfeld ermittelt. In RAW 264.7 Makrophagen wurden 196 Gene als Hypoxie-reguliert 85 Gene als DETA-NO-reguliert identifiziert. Die Mehrzahl der Gene (292) wurde jedoch von einer Kombination aus Hypoxie und DETA-NO reguliert und lediglich 14 Gene wurden in allen drei Ansätzen identifiziert. Aus der Gruppe der durch Hypoxie-und DETA-NO-regulierten Transkripte zeigte Sesn2 als Peroxiredoxin (Prdx) Reparatur-Protein eine signifikant höhere Induktion durch DETA-NO im Vergleich zur Hypoxie. Mit Hilfe von HIF-1α-/- Maus-Peritonealmakrophagen wurde Sesn2 als sowohl Hypoxie- und NO-reguliertes HIF-1α Zielgen identifiziert. Eine Vorinkubation der RAW 264.7 Zellen mit DETA-NO reduzierte die Bildung von überoxidiertem, inaktivem Prdx durch H2O2. Die Reduktion an überoxidiertem Prdx durch eine Vorinkubation mit DETA-NO konnte mittels eines siRNA knockdowns auf Sesn2 zurückgeführt und Sesn2 als Prdx-Reduktase etabliert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Vorinkubation von Makrophagen mit NO die Akkumulation von Sesn2 HIF-1α-abhängig induziert und somit Prdxs vor einer Überoxidierung durch ROS schützt. Die Aktivierung von HIF-1α durch Hypoxie oder NO kann somit die Vitalität von Zellen in einem entzündlichen Mikroumfeld verbessern. Im zweiten Teil meiner Arbeit wurde mittels konditioneller knockouts von HIF-2α und HIF-2α in myeloiden Zellen deren Auswirkung auf die Tumorentwicklung im PyMT Tumormodell untersucht. Die Tumorbelastung der Tiere zeigte in Folge der myeloiden knockouts von 1α und HIF-2α nur eine leichte Tendenz zu geringerer Tumorbelastung. Im Gegensatz zum myeloiden HIF-2α knockout beschleunigte der knockout von HIF-1α die Tumorinzidenz in PyMT Mäusen verlangsamte jedoch die Tumorentwicklung. Zusätzlich führte der myeloide knockout von HIF-1α und HIF-2α zu verstärkter Tumorhypoxie. Dies konnte auf eine Beeinträchtigung der Tumorangiogenese in den Tumorkernzonen zurückgeführt werden, wobei die Angiogenese durch das Fehlen von myeloidem HIF-1α am stärksten beeinträchtigt wurde. Während der Entstehung eines Tumors und dessen Progression werden die Tumorumgebung, das sogenannte Stroma, und der Tumor selbst von unterschiedlichen Immunzellen infiltriert. Der myeloide knockout von HIF-1α hatte erheblichen Einfluss auf die Immunzellverteilung im Tumorgewebe. Es wanderten weniger Makrophagen und B Zellen in den Tumor ein, wohingegen die Zahl von CD4+ T Helfer Zellen signifikant erhöht war. Zusätzlich wurde die Reifung der Dendritischen Zellen (DCs) durch den myeloiden knockout von HIF-1α erheblich beeinträchtigt. Der myeloide knockout von HIF-2α resultierte lediglich in einer verminderten Zahl an B Zellen und T Zellen im Tumorgewebe. Wildtyp und HIF-2α-/- Makrophagen, die hypoxische Tumorareale infiltrierten wiesen eine erhöhte Akkumulation von HIF-1α Protein auf. Makrophagen mit einem knockout von HIF-1α zeigten daraus folgend keine Akkumulation des HIF-1α Proteins in hypoxischen Tumorarealen. Darüber hinaus wurde Ym1 in allen Makrophagen-Genotypen im Tumorgewebe gleichstark exprimiert, wohingegen die Expression von iNOS im Tumorgewebe durch den myeloiden knockout von HIF-1α und HIF-2α verringert war. Die kolokalisierte Expression von iNOS und Ym1 in den Tumor-assoziierten Makrophagen deutet auf eine sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Aktivierung der Makrophagen im Tumor hin. Die Ergebnisse der Immunzellverteilung von Makrophagen, unreifen DCs, CD4+ T Helfer Zellen sowie auch die verminderte iNOS-Expression weisen jedoch auf ein eher anti-inflammatorisches Tumormileu der PyMT+/-/HIF-1α -/- Tiere hin. Dies zeigt, dass HIF-1α in Makrophagen an der Entstehung eines inflammatorischen Tumormileus beteiligt ist.
• Hypoxia and NO are major mediators of acute or chonic diseases as well as of tumors. Macrophages are crucial for pathogen elimination but also induction, progression and escape of tumors. They infiltrate wounded tissue, inflammatory sites or malignant tumors. This results in their exposure to a hyopoxic environment including NO and ROS causing extensive cellular stress. Cell metabolism and redox homeostasis are considerably affected by an inflammatory microenvironment. In the first part of this study I investigated via microarray analysis the interaction of hypoxic and NO signals in macrophages and their impact on cells in an inflammatory environment. I identified 196 hypoxia-regulated genes in RAW 264.7 macrophages. 85 genes were regulated by DETA-NO but the majority of genes (292) were regulated by a combination of hypoxia and DETA-NO. Only 14 genes were regulated by all treatments. The Prdx repair protein Sesn2 is a hypoxia- and NO-regulated gene that shows a significant higher induction of Sesn2 after DETA-NO compared to hypoxia. With HIF-1α-/- peritoneal mouse macrophages Sesn2 was identified as a hypoxia-and NO-regulated HIF-α target gene. Preincubation of RAW 264.7 cells with DETA-NO resulted in reduced H2O2-dependent Prdx overoxidation and enzymatic inactivation. Experiments with a siRNA knockdown showed that the reduction of overoxidized Prdx after preincubation with DETA-NO is Sesn2-dependent. This identifies Sesn2 as a Prdx reductase in this system. Taken together I propose that a preincubation of macrophages with NO accumulates Sesn2 in a HIF-1-dependent manner and protects Prdxs against overoxidation and inactivation by ROS. Activation of HIF-1 by hypoxia or NO can improve the cell viability in an inflammatory environment through induction of the Prdx repair protein Sesn2. In the second part of this study I investigated the role of myeloid HIF-1α and HIF-2α in the tumor development of PyMT mice. The myeloid knockout of HIF-1α and HIF-2α resulted in a slightly reduced tumor burden. In contrast to the myeloid HIF-2α knockout of HIF-1α accelerated tumor incidence but retarded tumorprogression. Additionaly the myeloid knockout of HIF-1α and HIF-2α caused an increase in tumor hypoxia due to an impairment of tumorangiogenesis in the core zones of the tumors with the myeloid knockout of HIF-1α showing the most dramatic effect. During tumor initiation tumor progression the stroma and the tumor itself are infiltrated by different immune cells. The myeloid knockout of HIF-1α mainly affected the distribution of immune cells in the tumor tissue. The numbers of infiltrating macrophages and B cells were reduced whereas the number of infiltrating CD4+ T helper cells was significantly increased. Additionally, the maturation of Dendritic Cells (DCs) was considerably impaired by the myeloid knockout of HIF-1α. The myeloid knockout of HIF-2α only resulted in decreased numbers of B and T cells infiltrating the tumor tissue. Wildtype and HIF-2α-/- macrophages accumulated HIF-1α protein when they infiltrated hypoxic tumor areas. HIF-1α-/- macrophages failed to accumulate HIF-1α protein in hypoxic areas as a consequence of the myeloid HIF-1α knockout. In additon Ym1 was equally expressed in tumors of all genotypes, whereas the myeloid knockout of HIF-1α and HIF-2α resulted in a reduced iNOS expression in tumor-associated macrophages. The colocalization of iNOS and Ym1 in tumor tissue indicates a coexistance of pro- and anti-inflammatory macrophages in the tumor environment. The data of the distribution of macrophages, immature DCs, CD4+ T helper cells as well as the reduced iNOS-expression are indicators for a more anti-inflammatory tumor environment of the PyMT+/-/HIF-1α-/- mice. This suggests that HIF-1α in macrophages promotes the progression of an inflammatory tumor environment.