Open Access

Sophia Okouoyo

• FTY720, ein synthetisches Sphingosin Analogon von Myriocin, ist ein neuartigerImmunomodulator, der in vivo Homing und Migration von Lymphozyten moduliertund hierbei die Immunantwort in verschiedenen Transplantations- undAutoimmunmodellen hemmt. Zudem konnte in aktuellen Untersuchungen einausgeprägter Anti-Tumor-Effekt von FTY720 in mehreren Krebszelllinien,einschließlich Leukämie-, Lymphoma- und Glioma-Zellen dargelegt werden. In vitroVersuche zeigten, dass FTY720 die Proliferation von malignen Zellen hemmtund/oder Apoptose in Krebszellen induziert. Im Rahmen dieser Dissertationuntersuchten wir zum ersten Mal die biologischen Wirkungen von FTY720 inhumanen Kolonkarzinomzellen. Zunächst wurde die Auswirkung von FTY720 auf das Wachstumsverhalten von dreiverschiedenen Kolonkarzinomzelllinien (Caco-2, HT-29 und HCT-116) durch dieMessung der Zell-Proliferation mittels BrdU-Einbau und Kristallviolett-Assay sowiederStoffwechselaktivität im MTT-Test ermittelt. Die Behandlung dieser Zelllinienmit steigenden Konzentrationen von FTY720 (6-15 μM) führte zu einer dosis- undzeitabhängigen Verminderung der Zell-Überlebensrate. Zur Charakterisierung dieserHemmung der Proliferation untersuchten wir mit Hilfe von Western blot Analysen dieExpression wichtiger Faktoren der Zellzykluskontrolle in Caco-2-Zellen unterWirkung von FTY720. Dabei konnten wir zeigen, dass die Expression des Cdk-Inhibitor p27Kip1 hochreguliert wird, während die von Cyclin D1 und Cdk4 starkreduziert werden, was auf einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase hindeutet. Dienachfolgende Untersuchung hinsichtlich einer Induktion von Apoptose zeigte eineSteigerung der DNA-Fragmentierung nach Behandlung mit FTY720, begleitet voneiner Zunahme der Bax/Bcl-2-Ratio als Zeichen einer Aktivierung desmitochondrialen (intrinsischen) Weges, und letztendlich einer Aktivierung vonCaspase-3. Ferner stellten wir fest, dass FTY720 zu einer signifikanten Steigerung derTRAIL-Protein-Expression führt und so möglicherweise Apoptose ebenfalls über denextrinsischen Signalweg vermittelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass der Anti-Tumor-Effekt von FTY720 mit einer Hemmung der Phosphorylierung vonp44/42MAPK, terminalem Stellglied des Ras/MAPK-Signalweges, und einer Induktion der Expression von PTEN, einem negativem Regulator des PI3K/Akt-Signalweges,einhergeht. Zusammenfassend ist festzustellen, dass FTY720 in vitro im kolorektalen Karzinomeinen ausgeprägten Anti-Tumor-Effekt besitzt, welcher durch eine Inhibition desZellwachstums über einen G1-Zellzyklusarrest und eine Induktion der Apoptose überden extrinsischen und den intrinsischen Weg vermittelt wird.
• FTY720, a synthetic sphingosine analogue of myriocin, is a novel immunomodulator,which in vivo homing and migration from lymphocytes modulate and thereby inhibitthe immune response in several transplantation and autoimmune models. Moreover,FTY720 has been recently reported to have a strong anticancer effect on severalcancer types including leukaemia, lymphoma and glioma cells. In vitro experimentsshowed that FTY720 inhibits the proliferation of malignant cells and/or inducesapoptosis in cancer cells. In this study we aimed for the first time to evaluate thebiological effect of FTY720 on human colorectal cancer cells. Firstly, the impact of FTY720 on cell growth of three different colon cancer cell lines(Caco-2, HT-29 and HCT-116) was assessed by measuring BrdU-incorporation,crystal violet staining and metabolic activity using MTT-assay. The incubation ofthese cell lines with increasing concentrations of FTY720 (6-15 μM) significantlyinhibited cell growth in a time- and dose-dependent manner. To characterize theinhibition of cell proliferation, we assessed the expression of cell cycle regulatorymoleculesby Western blot analyses in FTY720-treated Caco-2 cells. An up regulationof Cdk inhibitor p27Kip1 protein levels was observed accompanied by down regulationof Cdk4 and Cyclin D1 protein levels, which indicate a cell cycle arrest in G1. Thenext experiment regarding apoptosis induction showed an increase of DNA fragmentsafter treatment with FTY720 accompanied by an increase of Bax/Bcl-2-ratio, meaningan activation of the mitochondrial (intrinsic) pathway, and at least an activation ofcaspase-3. Furthermore FTY720 induces a significant increase of TRAIL-expressionand thereby may mediate apoptosis also through the extrinsic pathway. Finally weassumed the anticancer effect of FTY720 to involve an inhibition of thephosphorylation of p44/42MAPK, a final step of the Ras/MAPK-pathway, and aninduction of the PTEN-expression, a negative PI3K/Akt-pathway regulator. Summarizing our findings we concluded that FTY720 has a strong anticancer effect inhuman colon cancer cells which is mediated through suppression ofproliferation viaG1-arrest and promoting apoptosis via induction of intrinsic and extrinsic pathways.