Open Access

Alexander Wittmann

• The importance of RNA in molecular and cell biology has long been underestimated. Besides transmitting genetic information, studies of recent years have revealed crucial tasks of RNA especially in gene regulation. Riboswitches are natural RNA-based genetic switches and known only for ten years. They directly sense small-molecule metabolites and regulate in response the expression of the corresponding metabolic genes. Within recent years, artificial riboswitches have been developed that operate according to user-defined demands. Hence, they represent powerful tools for synthetic biology. This study focused on the development of engineered catalytic riboswitches for conditional gene expression in eukaryotes. A self-cleaving hammerhead ribozyme was linked to a tetracycline binding aptamer in order to regulate ribozyme cleavage allosterically with tetracycline. By integrating such a hybrid molecule into a gene of interest, mRNA cleavage and thereby gene expression is controllable in a ligand dependent manner. The linking domain between ribozyme and aptamer was randomised. Tetracycline inducible ribozymes were isolated after eleven cycles of in vitro selection (SELEX). 80% of the analysed ribozymes show cleavage that strongly depends on tetracycline. In the presence of 1 μM tetracycline, their cleavage rates are comparable to that of the parental hammerhead ribozyme. In the absence of tetracycline, cleavage rates are inhibited up to 333-fold. The allosteric ribozymes bind tetracycline with similar affinity and specificity as the parental aptamer. Ribozyme cleavage is fully induced within minutes after addition of tetracycline. Interestingly, the isolated linker domains exhibit structural consensus motives rather than consensus sequences. When transferred to yeast, three switches reduced reporter gene expression by 30 - 60% in the presence of tetracycline; none of them controlled gene expression in mammalian cells. In vitro selected molecules do not necessarily retain their characteristics when applied in a cellular context. Therefore, high throughput screening and selection systems have been developed in mammalian cells. The screening system is based on two fluorescent reporter proteins (GFP and mCherry). 1152 individual constructs of the selected ribozyme pool were tested, but none of them reduced reporter gene expression significantly in the presence of tetracycline. The selection system employs a fusion peptide encoding two selection markers (Hygromycin B phosphotransferase and HSV thymidine kinase) facilitating both negative and positive selection. 6.5 x 104 individual constructs of the selected ribozyme pool are currently under investigation.
• Riboswitche - Natürliche RNA-basierte Genschalter Neben der eher passiven Rolle als Überträger generischer Information ist RNA auch zentraler Bestandteil von zahlreichen biologisch relevanten Prozessen. Das bekannteste Beispiel hierfür ist wohl die Peptidyltransferase Reaktion des Ribosoms. Dass RNA in vielen dieser Prozesse essentielle Funktionen ausübt, ist allerdings erst seit wenigen Jahren bekannt. Riboswitche sind natürlich vorkommende, RNA-basierte Genschalter und wurden 2002 zum ersten Mal beschrieben. Sie sind in den nicht-kodierenden Bereichen von messenger RNAs (mRNA) lokalisiert und bestehen aus zwei Domänen, einer Aptamerdomäne und einer Expressionsplattform. Die Aptamerdomäne ist in der Lage, bestimmte niedermolekulare Metabolite wie Nukleobasen, Aminosäuren oder Vitamine hoch affin und sehr spezifisch zu binden. Durch die Bindung des Metaboliten kommt es zu einer strukturellen Änderung innerhalb der Aptamerdomäne (adaptive Bindung). Die Expressionsplattform interpretiert den Bindezustand der Aptamerdomäne und reguliert in Abhängigkeit davon die Expression des nachfolgenden Gens. Riboswitche kontrollieren in den meisten Fällen die Transkriptionstermination oder die Initiation der Translation. Auf Transkriptionsebene wird durch die ligandeninduzierte Konformationsänderung der Aptamerdomäne die Ausbildung eines Transkriptionsterminators gesteuert. Bei der Translation wird die Zugänglichkeit der Shine-Dalgarno Sequenz reguliert. Einen außergewöhnlichen RNA-Schalter stellt der glmS riboswitch aus Gram-positiven Bakterien dar. Durch Bindung seines Liganden Glucosamin-6-Phosphat wird die autokatalytische Spaltung des Schalters induziert und somit die Degradationsrate der glmS mRNA kontrolliert. Riboswitche wurden in allen drei Domänen des Lebens gefunden, wobei die meisten Schalter aus Bakterien stammen. In Eukaryoten konnte man bisher nur einige wenige Schalter in Pilzen und Pflanzen identifizieren. Hier sind riboswitche an der Prozessierung von mRNAs involviert (alternatives Spleißen und Polyadenylierung). Synthetische Riboswitche Innerhalb der letzten Jahre wurden synthetische riboswitche mit maßgeschneiderten und benutzerdefinierten Funktionen entwickelt, wodurch sich neue, vielseitige Anwendungsmöglich-keiten im Bereich der Synthetischen Biologie ergeben. Alle künstlichen RNA-Schalter nutzen Aptamere als sensorische Domäne. Aptamere sind kurze DNA oder RNA Sequenzen, die bestimmte Liganden hoch affin und sehr spezifisch binden. Sie können über ein in vitro Selektionsverfahren (SELEX: systematic evolution of ligands by exponential enrichment) gegen nahezu jedes Ziel entwickelt werden. Hierfür wird eine RNA Bibliothek aus etwa 1014 individuellen RNA Molekülen mit einem immobilisierten Zielmolekül inkubiert. Nicht bindende RNAs werden durch intensives Waschen entfernt; die gebundenen RNAs werden spezifisch eluiert, amplifiziert und weiteren Zyklen der Selektion unterworfen. Durch eine ständige Steigerung des Selektionsdrucks lassen sich Aptamere generieren, die ihr Zielmolekül mit einer Affinität im picomolaren Bereich binden. Bisher wurden Aptamere gegen Ionen, niedermolekulare Substanzen wie Aminosäuren und Antibiotika, Proteine, Viren oder gar ganze Zellen selektiert. Bei vielen Aptameren kommt es durch die Bindung des Liganden zu einer Konformations-änderung (adaptive Bindung). Diese Eigenschaft kann, ähnlich wie bei den natürlichen riboswitchen, für die Entwicklung von synthetischen RNA-Schaltern genutzt werden. Inseriert man ein Aptamer zum Beispiel in der Art in eine bakterielle mRNA, dass die Shine-Dalgarno Sequenz in das Aptamer integriert ist, so kann über die Bindung des Liganden die Zugänglichkeit der Shine-Dalgarno Sequenz kontrolliert werden. In eukaryotischen mRNAs wurden Aptamere direkt vor das Startcodon integriert. Durch Bindung des Liganden wurde das Aptamer derart stabilisiert, dass das scanning des Ribosoms behindert wurde. Komplexere synthetische riboswitche nutzen neben Aptameren auch Ribozyme (katalytische RNAs). Durch Fusion eines Aptamers mit einem sich selbstschneidenden Ribozyms wurden synthetische allosterische Ribozyme erschaffen. Hierbei wird die katalytische Spaltaktivität des Ribozyms allosterisch über das Aptamer reguliert. Integriert man solch ein allosterisches Ribozym in ein Gen, so lässt sich die Integrität der mRNA und somit auch die Expression des Gens liganden-abhängig steuern. Da bei dieser Art der Regulation keine speziesspezifischen Komponenten wie die bakterielle Shine-Dalgarno Sequenz oder das ribosomale scanning bei Eukaryoten involviert sind, gelten allosterische Ribozyme als speziesunabhängige Genregulatoren. Riboswitche können alle Funktionen eines Genschalter - also die Wahrnehmung eines Stimulus und in Antwort darauf die Regulation der Genexpression - selbstständig und ohne die Hilfe von Cofaktoren ausüben. Deshalb eignen sie sich besonders für die Entwicklung von synthetischen Gen-regulatoren, da über SELEX und RNA-engineering RNA-Schalter mit maßgeschneiderten Fähigkeiten und Funktionen generiert werden können. Zudem kommt es bei der Anwendung von RNA-Schaltern in Eukaryoten selten zu einer Aktivierung der Immunantwort durch den exogenen Schalter. Dies ist ein häufiges Problem bei Protein-basierten Systemen, da diese meistens auf bakteriellen Transkriptionsaktivatoren oder -repressoren beruhen. Ziel dieser Arbeit Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von künstlichen RNA-Schaltern für die konditionale Genexpression in Eukaryoten. Die Schalter sollten aus zwei Komponenten bestehen: Einem sich selbstschneidenden Ribozym und einem Tetrazyklin-bindenden Aptamer. Beide Komponenten sollten fusioniert werden, um die autokatalytische Spaltung des Ribozym allosterisch über Tetrazyklin zu regulieren. Der Fusionsbereich sollte randomisiert und funktionale Schalter über in vitro Selektion (SELEX) unter physiologischen Bedingungen von Säugtierzellen selektiert werden. Desweiteren sollten Hochdurchsatz Screening- und Selektionssysteme für riboswitche in humanen Zellen etabliert werden. Entwicklung von Tetrazyklin-induzierbaren Ribozymen Als sich selbstspaltendes Ribozym wurde das hammerhead Ribozym N79 von Schistosoma mansoni gewählt, da es bereits erfolgreich zur Repression eines Reportergens in einem Mausmodel genutzt wurde. Ein Aptamer, welches Tetrazyklin hoch affin (0,8 nM) und sehr spezifisch bindet, wurde an das Ribozym fusioniert. Tetrazyklin eignet sich besonders als Induktor für eukaryotische Genregulationssysteme, da es geringe Zytotoxizität bei Eukaryoten aufweist und außerdem sehr gut in eukaryotische Zellen aufgenommen wird. Der Fusionsbereich zwischen Ribozym und Aptamer wurde randomisiert und die RNA Bibliothek über in vitro Selektion (SELEX) nach Tetrazyklin-induzierbaren Ribozymen selektiert. Die Selektionsbedingungen waren dabei an die zellulären Bedingungen von Säugetieren angelehnt (0,5 mM MgCl2, pH7,5, 37°C). Während der SELEX wurde ein zweistufiges Selektionsschema angewandt. Zuerst wurde die RNA Bibliothek in Abwesenheit von Tetrazyklin inkubiert. Nach Partitionierung über denaturierende Gelelektrophorese wurden nur diejenigen Moleküle isoliert, welche in Abwesenheit von Tetrazyklin keine Spaltaktivität aufwiesen (negative Selektion). Diese Moleküle wurden daraufhin in Anwesenheit von 1 μM Tetrazyklin inkubiert. Nun wurden diejenigen Moleküle, bei denen das Ribozym gespalten hatte, isoliert (positive Selektion) und anschließend amplifiziert. Der Zyklus aus Selektion und Amplifikation wurde mehrmals wiederholt. Im Verlauf der in vitro Selektion wurde dabei die Stringenz schrittweise erhöht, indem einerseits die Inkubationszeit der negativen Selektion verlängert (bis zu 2,5 Stunden) und andererseits die Inkubationszeit der positiven Selektion verkürzt wurde (bis zu 1 Minute). Dadurch sollten allosterische Ribozyme selektiert werden, die in Abwesenheit von Tetrazyklin über einen langen Zeitraum katalytisch inaktiv bleiben, nach Zugabe von Tetrazyklin jedoch schnell aktiviert werden. Nach elf Runden in vitro Selektion war der Anteil an induzierbaren Ribozymen auf 22% angestiegen. Zu diesem Zeitpunkt begannen jedoch auch verkürzte, also Deletionen enthaltende Ribozyme angereichert zu werden. Aus diesem Grund wurde die in vitro Selektion nach der elften Runde beendet. Die Sequenzierung der Runden 9 und 11 ergab, dass die isolierten Fusionsbereiche zwischen Ribozym und Aptamer kaum Konsensussequenzen, sondern eher Übereinstimmungen in ihren strukturelle Motive aufwiesen. Charakterisierung der Tetrazyklin induzierbaren Ribozyme 28 isolierte Ribozyme wurden bezüglich ihrer Spaltaktivität untersucht. 22 von ihnen (80%) zeigten dabei eine starke Tetrazyklin Abhängigkeit. Während ihre Spaltgeschwindigkeit in Anwesenheit von 1 μM Tetrazyklin vergleichbar mit der des Ursprungsribozyms war, so erfolgte die Spaltung in Abwesenheit von Tetrazyklin bis zu 333-fach langsamer. Wurden die Ribozyme zuerst in Abwesenheit von Tetrazyklin inkubiert und dieses dann in einer Endkonzentration von 1 μM zugegeben, so zeigte sich, dass ihre Spaltung innerhalb weniger Minuten nach Zugabe vollständig induziert war. Die allosterischen Ribozyme wiesen dabei eine vergleichbare Bindeaffinität für Tetrazyklin wie das Aptamer auf. Desweiteren zeigten die Ribozyme eine vergleichbare Bindespezifität, da ihre Spaltung nur mit Tetrazyklin, nicht aber mit Doxycyclin induziert werden konnte. Das Aptamer bindet Doxycyclin mit etwa 150-fach schlechterer Affinität. Die isolierten Ribozyme zeigten also immer noch die hervorragenden Eigenschaften ihrer einzelnen Komponenten (schnelle Spaltung unter physiologischer Magnesiumkonzentration sowie hohe Bindeaffinität und -spezifität für Tetrazyklin). Über in vitro Selektion konnten mehrere allosterische Ribozyme isoliert werden, bei denen die Spaltung über Tetrazyklin allosterisch regulierbar ist (bis zu 333-fach), wodurch eine mögliche Regulation der Genexpression mit diesen Schaltern durchaus plausibel erscheint. Allosterische Ribozyme in zellulären Systemen Die isolierten Ribozyme aus Runde 9 und 11 wurden daraufhin auf ihr regulatorisches Potential in Eukaryoten untersucht. Zuerst musste jedoch ein geeigneter Insertionsort innerhalb eukaryotischer mRNAs gefunden werden. Experimente mit katalytisch aktiven und inaktiven Ribozymkontrollen zeigten, dass der beste Insertionsort der 3‘ untranslatierte Bereich (UTR) direkt nach dem Stopcodon ist. Dort hat die Insertion eines Ribozyms keinen detektierbaren Einfluss auf die Translation und das katalytisch aktive Ribozym reduziert die Genexpression auf Hintergrundniveau. Im 5‘ UTR hingegen war die Genexpression bereits beim inaktiven Ribozym um etwa die Hälfte verringert. Das katalytisch aktive Ribozym reduzierte die Genexpression weiter auf Hintergrundniveau. Aus Experimenten mit Aptameren war bereits bekannt, dass stabile RNA-Strukturen das scanning eines eukaryotischen Ribosoms inhibieren können. Aus diesem Grund wurden die allosterischen Ribozyme fast ausschließlich in den 3‘ UTR integriert. In Hefe konnten funktionale allosterische Ribozyme gefunden werden. Drei Schalter reduzierten die Expression eines Reportergens in Anwesenheit von Tetrazyklin um 30 bis 60%. In humanen Zellen konnte hingegen kein funktionaler Schalter gefunden werden. Von in vitro selektierten Aptameren ist bekannt, dass die Moleküle, die in einer Selektion am stärksten angereichert wurden, nicht unbedingt auch diejenigen sind, welche in der Zelle als riboswitch agieren können. Die regulatorischen Moleküle waren hingegen stark unterrepräsentiert und konnten nur über ein anschließendes in vivo Screening identifiziert werden. Aus diesem Grund wurden Hochdurchsatz-Screening- und Selektionssysteme in humanen Zellen entwickelt. Das Screeningsystem basiert auf zwei fluoreszierenden Reporterproteinen (GFP und mCherry). 1152 individuelle allosterische Ribozyme der angereicherten RNA Bibliothek wurden analysiert, jedoch konnte kein funktionaler Schalter identifiziert werden. Der Vorteil von Selektion gegenüber Screening ist, dass eine größere Anzahl an Varianten untersucht werden kann. Für das Selektionssystem wurde ein Fusionspeptid aus zwei eukaryotischen Selektionsmarkern benutzt. Die Hygromycin B Phosphotransferase vermittelt Resistenz gegen Hygromycin B und erlaubt somit eine positive Selektion. Die Thymidin Kinase des Herpes Simplex Virus wandelt den per se nicht toxischen Vorläufer Ganciclovir in ein toxisches Intermediat um, womit negative Selektion möglich ist. Aktuell werden 6,5 x 104 Ribozyme der angereicherten RNA Bibliothek mit diesem Selektionsverfahren untersucht. Abschließend lässt sich sagen, dass die Entwicklung von allosterischen Ribozyme durch die Kombination von Ribozym und Aptamer über einen randomisierten Fusionsbereich gefolgt von einer in vitro Selektion möglich ist. Über geeignete Selektionsbedingungen lassen sich synthetische Hybridmoleküle generieren, bei denen die einzelnen Komponenten hervorragend miteinander kommunizieren können und dennoch die grundlegenden Eigenschaften der Komponenten erhalten bleiben. Der Transfer dieser Moleküle aus dem in vitro System in zelluläre Systeme birgt jedoch erhebliche Schwierigkeiten und legt ein Screening unter zellulären Bedingungen als essentiellen Schritt nach der in vitro Selektion nahe. Die in dieser Arbeit entwickelten Screening- und Selektionssysteme werden die Entwicklung von synthetischen RNA-Schaltern für die Anwendung in humanen Zellen erheblich beschleunigen, da mit ihnen Verfahren im Hochdurchsatz durchführbar sind.