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Lydia Jasmin Dürner

• The display of foreign polypeptides and proteins on the surface of viruses or cells provides an important tool for the engineering of biomolecules and the analysis of their interactions with binding partners. The most extensively used display platform is the coat protein of the filamentous bacteriophage (Smith, 1985). Phage display libraries have often been selected for polypeptides, e.g. single chain (sc) antibodies that bind to a protein of interest, but in vivo selection could only be demonstrated for peptides so far. An alternative display platform is the retrovirus murine leukemia virus (MLV). Here, polypeptides are displayed at the N-terminus of the viral envelope glycoprotein. Proof of principle for this platform was demonstrated for protease substrate libraries, which can be selected through coupling proteolytic activation with viral infectivity (Buchholz et al., 1998). Selection of the library CX4A on living cells resulted in viruses with more than three orders of magnitude improved spreading efficiency through tumor cells (Hartl et al., 2005). Also scAb libraries have recently been displayed and selected using retroviruses (Urban et al., 2005). The library scFvlibxMo displays the repertoire of phage display preselected sc antibodies for laminin-1 binding. The retrovirus based selection process resulted in laminin-specific sc antibodies with improved expression levels in mammalian cells. This thesis describes the in vivo (i.e. in mouse tumor models) selection of the C-X4-A and scFvlibxMo for tumor homing upon systemic delivery. For selection of the protease substrate library C-X4-A a subcutaneous tumor was induced in SCID mice followed by three systemic injections of the library. The selection process was monitored over a period of 34 days. After the incubation period mice were sacrificed and virus load in organs and tumor determined. PCR analysis after 34 days showed that virus from the library had preferentially infected the tumor. Sequence analysis showed the selection of protease substrates with the most prominent one with a frequency of over 65%. The four most prominent protease substrate variants where reconstituted into the original viral backbone for further investigation (C-SK-A, C-HI-A, C-HM-A and C-HS-A). Interestingly, these viruses exhibited a reduced spreading capacity in vitro on HT1080 cells as compared to the C-AK-A virus, which had previously been selected on HT1080 cells. When assayed for tumor homing, however, viruses C-HI-A and C-HS-A had clearly improved in comparison to C-AK-A. Tumor tissue had been infected at rates of over 55% while virus load of extratumoral organs was very low (infection rates <0.7 for C-HS-A and <0.02 for C-HI-A). Tumor targeting capacity had thus been improved over 10-fold by the in vivo selection of the C-X4-A library. The experimental set up for the in vivo selection of the scFvlibxMo library was performed according to that of the C-X4-A library. Fingerprint analysis of the selected viruses that infected tumor tissue resulted in the identification of seven antibody variants showing unique CDR3 sequences. Two prominent clones (M49T-A and M49T-B) were cloned back into the MoMLV genome for further analysis of the reconstituted viruses. While variant B bound laminin-1 efficiently, variant A was unable to do so, although it was selected at highest frequency (76%). Both reconstituted viruses were equally well infectious and spread through HT1080rec1 cells at a similar efficiency as MoMLV. In an in vivo competition experiment the selected viruses clearly out-competed a laminin-1 binding reference virus L36xMo for tumor homing. To understand the molecular driving forces behind the in vivo selection process the epitope of the selected scFv M49T-A was identified using a phage peptide library approach. In silico analysis led to the identification of a small group of possible antigens, including tenascin, fibronectin and collagen. The data described in this thesis demonstrate that the retrovirus display platform is capable of allowing the in vivo selection of protease substrates and scFvs. Notably, the replication competence of the system introduced an additional level of complexity to the library. The performed in vivo selections significantly enhanced tumor tropism. Selective infection of tumor cells combined with transfer of anti-tumoral genes is an attractive strategy for cancer therapy being in focus of current research. The viruses selected in this thesis build prime candidates for targeted retrovirus based tumor therapy.
• Zur Entwicklung von Biomolekülen und zur Analyse ihrer Bindungspartner hat sich die Präsentation (Display) von Polypeptiden und Proteinen auf der Oberfläche von Viren und Zellen als ein wichtiges Werkzeug etabliert. Die am häufigsten verwendete Plattform ist das Hüllprotein filamentöser Bakteriophagen (Smith, 1985), das z.B. zur Präsentation und Selektion von einzelkettigen Antikörpern (scAb) verwendet wird. Solche Selektionen erfolgen in der Regel in vitro an immobilisiertem Antigen. In vivo konnten bisher nur Peptid-präsentierende Phagen-Bibliotheken selektioniert werden. Eine alternative Plattform stellt das retrovirale Display dar. Das hierfür genutzte murine Leukämievirus (MLV) kann Polypeptide als N-terminale Fusion seines viralen Hüllproteins präsentieren. Diese Display-Plattform wurde zuerst für eine Proteasesubstrat-Bibliothek genutzt, in der die proteolytische Abspaltung einer Blockierungsdomäne zur Aktivierung der viralen Infektiösität führte (Buchholz et al., 1998). Um die Proteaseaktivität von Tumorzellen für eine Aktivierung der Viren zu nutzen, und so Tumorspezifität zu erreichen, wurde die retrovirale Proteasesubstrat-Bibliothek C-X4-A auf einer kultivierten Tumorzelllinie selektioniert. Die so erhaltenen Substrate ermöglichten eine um drei Größenordnungen erhöhte Ausbreitungseffizienz der Viren in Tumorzellen gegenüber Virus mit Standardsubstrat (Hartl et al., 2005). Vor Beginn der vorliegenden Arbeit wurde zudem erstmals eine scAb Bibliothek mittels retroviralem Display selektioniert (Urban et al., 2005). Die Bibliothek scFvlibxMo präsentiert ein mittels Phagen-Display auf Laminin-1 vorselektioniertes scAb-Repertoire. Ihre Selektion auf Laminin-1 resultierte in scAb mit erhöhter Expressionsrate in Säugetierzellen gegenüber scAb aus Phagen-basierten Selektionen (Urban et al., 2005). Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals die in vivo Selektion (d.h. in einem Maus-Tumor-Model) von retroviralen Display-Bibliotheken: aus den beiden Bibliotheken C-X4-A und scFvlibxMo wurden nach systemischer Verabreichung Varianten identifiziert, die sich präferentiell im Tumor ausbreiten konnten. Zur Selektion der Proteasesubstrat-Bibliothek C-X4-A wurden subkutane Tumore in SCID-Mäusen induziert und die Bibliothek systemisch verabreicht. Zur Analyse des Selektionsprozesses wurden die Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten getötet und die Virusmenge in Organen und Tumor mittels PCR bestimmt. Nach 34 Tagen zeigte sich eine präferentielle Infektion des Tumorgewebes. Eine Sequenzanalyse bestätigte die Selektion von Proteasesubstraten und die vier häufigsten wurden zur weiteren Charakterisierung im originalen viralen Kontext rekonstruiert (C-SK-A, C-HI-A, C-HM-A and C-HS-A). Die Viren C-HI-A und C-HS-A waren im Vergleich zu C-AK-A, das aus der in vitro Selektion stammte, in ihrer der Tumoranreicherung deutlich verbessert und die Tumortargeting-Kapazität (Verhältnis von Tumorinfektion gegen Infektionen im extratumoralen Gewebe) hatte sich durch die Selektion in vivo mehr als verzehnfacht. Die in vivo Selektion der scFvlibxMo Bibliothek wurde analog zur C-X4-A Selektion durchgeführt. Eine „Fingerprint“ Analyse der selektionierten Viren im Tumor identifizierte vier Antikörpervarianten mit einzigartigen CDR3 Sequenzen. Die zwei häufigsten Klone (M49T-A und M49T-B) wurden zur weiteren Untersuchung im originalen MLV-Kontext rekonstruiert. Interessanterweise konnte für M49T-B die Bindung an Laminin-1 nachgewiesen werden, für M49T-A allerdings nicht. Beide Viren waren gleich infektiös und zeigten eine ähnliche Ausbreitungskinetik in Zellkultur wie MLV. In Kompetitionsexperimenten in vivo übertrafen die selektionierten Viren deutlich das Referenzvirus L36xMo in der Effizienz der Tumorinfektion. Um die treibenden molekularen Kräfte der in vivo Selektion besser verstehen zu können, wurde das Epitop des selektionierten scAb M49T-A mittels Phagenpeptiddisplay bestimmt. Die in silico Analyse führte zur Identifikation einer kleinen Gruppe möglicher Antigene, darunter Tenascin, Fibronektin und Kollagen. Die hier präsentierten Daten demonstrieren erstmals die Anwendbarkeit des retroviralen Displays zur in vivo Selektion von Proteasesubstraten und scAb. Die so selektionierten Viren übertrafen in ihrer Tumortargeting-Kapazität signifikant Varianten aus in vitro Selektionen. Die zielgerichtete Infektion von Tumorzellen kombiniert mit dem Transfer von antitumoralen Genen ist eine attraktive Strategie zur Krebstherapie, welche im Mittelpunkt aktueller Forschungsaktivitäten steht. Die in dieser Arbeit selektionierten Viren stellen mögliche Kandidaten für die zielgerichtete, Retrovirus-basierende Tumortherapie dar.