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Meike Ochs

• 5-Lipoxygenase (5-LO) catalyzes the two initial steps in the biosynthesis of leukotrienes, a group of inflammatory lipid mediators derived from arachidonic acid. Here, the regulation of 5-LO mRNA expression by alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay (NMD) was investigated. In the present study, the identification of two truncated transcripts and four novel 5-LO splice variants containing premature termination codons (PTC) was reported. The characterization of one of the splice variants, 5-LOΔ3, revealed that it is a target for NMD since knockdown of the NMD factors UPF1, UPF2 and UPF3b in the human monocytic cell line Mono Mac 6 (MM6) altered the expression of 5-LOΔ3 mRNA up to 2-fold in a cell differentiation-dependent manner suggesting that cell differentiation alters the composition or function of the NMD complex. In contrast, the mature 5-LO mRNA transcript was not affected by UPF knockdown. Thus, the data suggest that the coupling of alternative splicing and NMD is involved in the regulation of 5-LO gene expression. RT-PCR analysis of different cell types revealed the existence of a large number of 5-LO splice variants. The most interesting splice variants were observed in BL41-E95A cells, which give a raise to novel 5-LO protein isoforms. This leads to the hypothesis of a novel regulatory mechanism in which the dimerization of 5-LO with 5-LO isoforms might regulate the 5-LO activity. The 5-LO protein expression was reduced on translational level in UPF1 knock down cells, suggesting that UPF1 has a positive influence on 5-LO translation. Therefore, a mass spectrometry based proteomics study was started to identify compartment specific protein expression changes upon UPF1 knockdown in differentiated and undifferentiated MM6 cells. The proteomics analysis demonstrated that the knockdown of UPF1 results in numerous protein changes in the microsomal fraction (~ 21%) but not in the soluble fraction (< 1%). Western blot data confirmed the trend of the proteomics analysis. This data suggest that UPF1 is a critical gene expression regulator in a compartment specific way. During differentiation by TGFβ and calcitriol the majority of UPF1 regulated proteins was adjusted to normal level. It appears that that not only the NMD mechanism alters its composition during differentiation. Also the gene expression regulation on translational level by UPF1 seems to be also cell differentiation dependent. An interesting group of UPF1 target genes represent the downregulated proteins. qRT-PCR analysis of randomly chosen genes revealed no effect on mRNA expression upon UPF1 knockdown, suggesting that UPF1 positively influences the translation of these genes. Computational sequence analysis identified a conserved C-rich sequence which might be a hnRNP E2-binding site. hnRNP E2 has been characterized as a translational repressor in myeloid cells. Western blot analysis revealed a differentiation independent up regulation of hnRNP E2 by UPF1 knockdown. Additionally, microRNA-328 (miR-328) has been described as an RNA decoy modulating hnRNP E2 regulation. Due to this, stem loop qRT-PCR showed an up regulation of miR-328 in TGFβ and calcitriol differentiated MM6 cells. Based on this data we suggest a model in which downregulation of UPF1 increases hnRNP E2 expression, leading to translation inhibition. During differentiation, miRNA-328 is upregulated thereby competing with hnRNP E2 leading to an efficient translation
• 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym der Leukotrienbiosynthese. Leukotriene bilden eine Gruppe von Arachidonsäure-Metaboliten, die während entzündlichen und allergischen Reaktionen synthetisiert und freigesetzt werden. In mehrere Studien konnte gezeigt werden, dass die 5-LO bei verschiedenen Krankheiten wie Asthma, Entzündungen und Krebs eine zentrale Rolle spielt. Die 5-LO wird überwiegend in reifen Leukozyten exprimiert, was mit der Funktion der Leukotriene als Entzündungsmediatoren in Einklang steht. Granulozyten, Monozyten / Makrophagen, Mastzellen, dentritische Zellen und B-Lymphozyten exprimieren 5-LO, hingegen weisen Thrombozyten, Endothelzellen sowie T-Lymphozyten keine 5-LO-Expression auf. Während der myeloischen Zellreifung wird die 5-LO-mRNA sowie die 5-LO-Proteinexpression durch Calcitriol und dem transformierenden Wachstumsfaktor β (TGFβ) Promoter-unabhängig hochreguliert. Die Existenz von 5-LO-Spleißvarianten konnte zuerst in humanen Hirntumoren nachgewiesen werden. Northern Blot-Analysen zeigten, dass vom 5-LO-Gen unterschiedliche mRNA-Transkripte im humanen Hirntumor und in Dimethylsulfoxid differenzierte HL-60 Zellen generiert werden. Dabei wurde die Hypothese aufgestellt, dass die 5-LO-Spleißvarianten eine Rolle bei den Tumor-induzierten Hirnödemen spielen. Erst kürzlich wurden zwei neue potenzielle 5-LO-Proteinisoformen in Leukozyten gefunden. Beide Isoformen sind katalytisch inaktiv und hemmen die zelluläre Enzymaktivität der 5-LO. Alternatives Spleißen ist für die Generierung unterschiedlicher mRNA-Transkripte verantwortlich. Studien zeigten, dass ungefähr die Hälfte der Gene des humanen Genoms alternativ gespleißt wird. RNA-Arrays und Sequenzierungen deuten darauf hin, dass bis zu 94% aller Gene alternative Spleißvarianten aufweisen. Ein Drittel dieser Transkripte werden jedoch durch nonsense mediated mRNA decay (NMD) abgebaut, da diese Spleißvarianten vorzeitige Stoppcodons aufweisen. Durch Änderung des Spleißmusters kann bei Bedarf sofort das reife mRNA-Transkript generiert werden. Damit stellt die Kombination aus alternativem Spleißen und NMD eine Ebene der posttranskriptionellen Regulation dar. In der vorliegenden Arbeit sollte die Regulation der 5-LO durch alternatives Spleißen und NMD in der humanen monozytären Zelllinie Mono Mac 6 (MM6) untersucht werden. Es konnten zwei verkürzte Transkripte und vier neue 5-LO-Spleißvarianten in MM6 Zellen identifiziert werden, die alle vorzeitige Stoppcodons aufweisen. Die Charakterisierung einer Spleißvariante (5-LOΔ3) zeigte, dass diese über NMD abgebaut wird. Durch die Inkubation mit dem Proteinbiosynthese-Inhibitor Puromycin und der Depletion von einzelnen NMD-Faktoren UPF1, UPF2 und UPF3b zeigte sich, dass 5-LOΔ3, aber nicht das reife 5-LO-Transkript über NMD reguliert wird. Interessanterweise stehen die Auswirkungen der Depletion von UPF1 und UPF3b auf die 5-LOΔ3-Expression in Abhängigkeit zum Differenzierungsstatus der Zellen. Dies deutet darauf hin, dass Zelldifferenzierung die Zusammensetzung bzw. die Funktion des NMD-Komplexes verändert. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass alternatives Spleißen in Verbindung mit NMD die 5-LO-mRNA-Expression reguliert.