Open Access

Johann Isaak

• Platelets from diabetic patients are characterised by hyperreactivity resulting in exaggerated adhesion, aggregation and thrombus formation which contribute to the development of cardiovascular complications known to be one of the main causes of diabetes-related mortality. One of the mechanisms suggested to be involved in the diabetes-related platelet hyperactivation is the increased [Ca2+]i which leads to the overactivation of Ca2+-dependent proteases, the calpains. Among the calpain isoforms expressed in platelets the two ubquitiously expressed μ- and m-calpain are thought to play an important role in physiological and pathophysiological processes. Particularly μ-calpain is known to be involved in many steps of physiological platelet activation such as aggregation, adhesion, secretion, and signalling. However, we could show that diabetes was associated with an enhanced activation of both μ- and m-calpain in platelets In the first part of the study we focussed on the characterization of the molecular mechanism regulating calpain activity. Indeed, although Ca2+ is considered to be the main regulator of the proteolytic activity of the conventional calpains, other mechanisms such as the presence of phospholipids and phosphorylation have been reported to affect their activity. Since most studies reported the phosphorylation of m-calpain we were interested to see whether μ-calpain activity might be also affected by phosphorylation. We could show that the activity of μ-calpain was enhanced by the PKC activator PMA suggesting its possible regulation by phosphorylation. However, whether PKC directly targeted μ-calpain remains unclear. Given that substrate recognition is important for a protease to process its substrate and since no common consensus could be attributed to calpain substrates, our next interest was to understand the mechanism regulating the recognition of its substrates by calpain. Since phosphorylation has been reported to protect different proteins from calpain degradation we investigated whether the calpain substrate CD31 could be phosphorylated in platelets and whether this could affect its recognition by calpain. Although we could show that the tyrosine phosphorylation of CD31 was increased after activation of platelets by thrombin and that this effect was attenuated in platelets from diabetic patients, tyrosine phosphorylation of CD31 seemed to have no effect on its sensitivity to calpain-mediated proteolysis. After the analysis of the mechanism regulating calpain activity as well as its interaction with its substrates, our next interest was the identification of new calpain substrates in platelets. Since a previous study from our group showed that PPARγ agonists could indirectly reverse the diabetes-associated calpain activation we performed DIGE analysis of platelet samples from diabetic patients before and after PPARγ agonist treatment. Using this approach we could identify four novel calpain substrates in platelets: Integrin-linked kinase (ILK), α parvin, CLP36 and septin-5. Next, we assessed the effect of calpain-mediated cleavage on the function of these newly identified proteins. We could show that μ-calpain was essential for the dissociation of ILK from the IPP complex and its activation while m-calpain-mediated cleavage led to its cleavage and inactivation. Functionally, we also showed that μ-calpain was involved in platelet adhesion while m-calpain was important for spreading. The next protein we analysed was septin-5, a small GTPase known to regulate platelet degranulation by association with other septins and syntaxin-4. We found that the interaction between septin-5 and syntaxin-4 was inhibitory for platelet degranulation. We could demonstrate that the μ-calpain-mediated cleavage dissociated septin-5 from syntaxin 4 and led to increased secretion of platelet α-granules. Next, we investigated the in vivo role of calpain in the diabetes-associated platelet hyperreactivity. We induced diabetes in mice and could reproduce calpain activation in platelets such as that found in human. Indeed, calpain activation in murine platelets also led to the cleavage of several calpain substrates including ILK and septin-5. Moreover, platelets from diabetic mice demonstrated an increased aggregation and thrombus formation in vivo. Treatment of the animals with the calpain inhibitor A-705253 (30 mg/kg/day for 10 days) significantly restored platelet function and substrate cleavage. In conclusion, in this part of the study, we could show that the increased calpain-dependent α-granule secretion and platelet adhesion may account for the enhanced vascular proliferation and thrombus formation in diabetes and calpain inhibition represents a promising way to prevent atherothrombosis development. In the last part of the study we analysed another enzyme known to play a crucial role in diabetes, the AMPK which is an energy-sensing kinase known to be impaired in diabetes. We could show that the two catalytic subunits AMPK α1 and α2 are expressed in platelets. The AMPKα2 seemed to be the subunit involved in platelet activation since AMPKα2-deficient mice demonstrated a defect in clot retraction and the stabilization of the thrombus while the animals showed a normal bleeding time. Mechanistically, we showed in platelets that the upstream kinase of AMPKα2 is LKB1 which was activated by thrombin stimulation via a PI-3K-dependent pathway. AMPKα2 then phosphorylated the Src-family kinase Fyn, which is responsible for the phosphorylation of its substrate β3 integrin on Tyr747. These data indicate that AMPKα2, by affecting Fyn phosphorylation and activity, plays a key role in platelet αIIbβ3 integrin signalling, leading to clot retraction and thrombus stability. Although the effect of diabetes in the AMPK-dependent pathway could not be investigated we assume that the dysregulation of this pathway may account for the thrombus destabilization and enhanced embolization encountered in diabetes.
• Thrombozyten von Diabetes Patienten werden als hyperreaktiv beschrieben, was zu überhöhten Reaktionen bei Adhäsion, Aggregation und Thrombusbildung führt. Dieser hyperreaktive Zustand wirkt sich auch auf andere Zellen im Blutkreislauf aus und trägt entscheidend zu der Entwicklung von kardiovaskulären Komplikationen bei, die als Hauptursache für die Mortalität bei Diabetikern bekannt sind. Die Ursachen für die Hyperreaktivität der Thrombozyten sind vielfältig. Einer der vorgeschlagenen Mechanismen ist die erhöhte intrazelluläre Ca2+ Konzentration, die zu einer Aktivierung der Ca2+-abhängigen Proteasen führt, der Calpaine. Unter anderem werden in Thrombozyten die ubiquitären Isoformen μ- und m-Calpain exprimiert. Und insbesondere μ-Calpain ist dafür bekannt, bei mehreren Schritten der physiologischen Thrombozytenaktivierung, wie Aggregation, Adhäsion, Sekretion und Signalweiterleitung, eine Rolle zu spielen. Wir konnten jedoch zeigen, dass sowohl m- als auch μ-Calpain in Thrombozyten von Diabetikern erhöhte Aktivität aufweisen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Fokus auf die Charakterisierung der molekularen Mechanismen gelegt, die die Aktivität von Calpain regulieren. Obwohl Ca2+ als Hauptregulierer der proteolytischen Aktivität der Calpaine betrachtet wird, wurden auch andere Mechanismen, wie die Anwesenheit von Phospholipiden oder Phosphorylierung, beschrieben, die die Aktivität beeinflussen können. Da die meisten Studien die Phosphorylierung von m-Calpain untersucht haben, sind wir der Frage nachgegangen, ob auch die Aktivität von μ-Calpain durch Phosphorylierung beeinflusst wird. Wir konnten zeigen, dass μ-Calpain durch den PKC Aktivator PMA aktiviert wurde, was eine mögliche Regulierung durch Phosphorylierung nahelegt. Jedoch konnte eine direkte Phosphorylierung von μ-Calpain durch PKC nicht nachgewiesen werden. Ein wichtiger Schritt zum Verständnis der molekularen Regulation der Protease ist auch die Substraterkennung. Da noch kein übereinstimmendes Erkennungsmotiv bei Calpain Substraten gefunden wurde, galt unser Interesse im Folgenden dem Verständnis der Mechanismen, die bei der Substraterkennung von Calpain eine Rolle spielen. Aufgrund früherer Arbeiten, die gezeigt haben, dass Phosphorylierung verschiedene Proteine vor einem Abbau durch Calpain schützt, haben wir untersucht, ob das Calpain Substrat CD31 in Thrombozyten phosphoryliert werden kann und ob das die Erkennung als Calpain Substrat beeinflusst. Obwohl wir zeigen konnten, dass die Aktivierung der Thrombozyten durch Thrombin zu einer erhöhten Tyrosin-Phosphorylierung führte und dass dieser Effekt in Thrombozyten von Diabetikern abgeschwächt war, hatte die Tyrosin-Phosphorylierung von CD31 keinen Einfluss auf dessen Proteolyse durch Calpain. Nach der Untersuchung der Mechanismen, die die Calpain-Aktivierung regulieren sowie der Interaktion mit den Substraten, war das nächste Ziel neue Calpain Substrate zu identifizieren. Da in einer vorherigen Studie von unserer Arbeitsgruppe gezeigt wurde, dass die Behandlung der Diabetiker mit PPARγ Agonisten die Calpain-Aktivierung in Thrombozyten wieder rückgängig gemacht hat, haben wir diese indirekte Methode genutzt um das Thrombozytenproteom auf Calpain Substraten zu analysieren. Wir haben Thrombozytenlysate von Diabetikern vor und nach Behandlung mit dem PPARy Agonisten Pioglitazone mittels DIGE analysiert. Dadurch konnten wir vier neue Calpain-Substrate identifizieren: ILK, α-parvin, CLP36 und Septin-5. Als Nächstes haben wir die Funktion der identifizierten Substrate in Thrombozyten und den Effekt der Spaltung durch Calpain untersucht. Im Fall der ILK konnten wir zeigen, dass die Kinase sowohl von μ- als auch von m-Calpain proteolysiert wurde, die Wirkung jedoch unterschiedlich war. Während μ-Calpain essentiell für die Dissoziation der ILK vom IPP-Komplex – zu dem auch α-parvin gehört – und für die Aktivierung der Kinase war, hat m-Calpain die ILK abgebaut und damit deaktiviert. Bei der Untersuchung der Adhäsion und dem Spreading von Thrombozyten konnten wir in dem Zusammenhang außerdem zeigen, dass μ-Calpain bei der Aktivierung und Adhäsion, während m-Calpain beim darauf folgenden Spreading eine Rolle spielte. Das nächste identifizierte Calpain Substrat war Septin-5 – eine kleine GTPase, die dafür bekannt ist, die Sekretion der Granula von Thrombozyten durch Assoziation mit anderen Septinen und Syntaxin-4 zu regulieren. Dabei wirkt die Interaktion zwischen Septin-5 und Syntaxin-4 inhibierend auf die Degranulation der Thrombozyten. Wir konnten demonstrieren, dass die Calpain-abhängige Spaltung von Septin-5 die Verbindung mit Syntaxin-4 auflöste, was zu einer verstärkten Sekretion von α-Granula durch Thrombozyten führte. Außerdem konnten wir nachweisen, dass die Moleküle und Faktoren, die Calpain-abhängig von Thrombozyten sekretiert wurden, eine proliferierende Wirkung auf kultivierte Endothelzellen hatten. Neben den molekularen Mechanismen waren wir auch an der in vivo Rolle von Calpain in der Diabetes-abhängigen Hyperreaktivität von Thrombozyten interessiert. Dafür wurde bei Mäusen Diabetes durch Streptozotozin-Injektion induziert. Das hat zu einer Aktivierung von Calpain in Thrombozyten geführt, ähnlich den Beobachtungen bei humanen Thrombozyten. Tatsächlich bewirkte die Aktivierung von Calpain in murinen Thrombozyten auch die Proteolyse mehrerer Calpain Substrate inklusive ILK und Septin-5. Außerdem wurden auch die Thrombozyten von diabetischen Mäusen auf ihre physiologischen Funktionen getestet. Eine erhöhte Aggregation und in vivo Thrombusbildung konnte auch hier festgestellt werden. Die Behandlung der Tiere mit dem Calpain Inhibitor A 705253 bewirkte eine Wiederherstellung der normalen Thrombozytenreaktivität, sowie der Regenerierung der Calpain Substrate auf ein normales Level. Zusammenfassend konnten wir in dem Teil der Arbeit zeigen, dass die Calpain-abhängige Thrombozyten Hyperreaktivität, belegt durch gesteigerte Sekretion der α-Granula, erhöhte Aggregation und Thrombozytenadhäsion, zumindest teilweise verantwortlich ist für das hohe Risiko bei Diabetikern an kardiovaskulären Komplikationen zu leiden. Und die Hemmung der Protease Calpain erweist sich als ein vielversprechender Ansatz, die Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen bei Diabetikern zu mindern. Im letzten Teil der Arbeit haben wir ein anderes Enzym analysiert, das bekannt ist für seinen wesentlichen Einfluss in der Entwicklung von Diabetes. Die AMPK ist eine Kinase, die als Energiesensor der Zelle bekannt ist und bei Diabetikern in ihrer Funktion beeinträchtigt ist. Von der Funktion in Thrombozyten war bisher jedoch nicht viel bekannt. Wir konnten zeigen, dass beide katalytischen Untereinheiten – AMPK α1 und α2 – in Thrombozyten exprimiert werden. Die AMPK α2 schien jedoch die wichtigere Untereinheit bei der Thrombozytenaktivierung zu sein, da Mäuse mit fehlendem AMPK α2-Gen einen Fehler bei der Blutgerinnsel Retraktion und der Stabilisierung des Thrombus aufwiesen. Bei der Untersuchung der molekularen Mechanismen fanden wir, dass AMPK α2 nach Stimulation der Thrombozyten mit Thrombin von der AMPK Kinase LKB1 phosphoryliert und aktiviert wurde. AMPK α2 Aktivierung führte dann zu einer Phosphorylierung von Fyn. Die zur Src-Familie gehörende Kinase Fyn wiederum phosphorylierte β3 Integrin, einem entscheidenden Schritt bei der Retraktion und Stabilisierung des Thrombus. Obwohl die Werte bei der Messung der Blutungszeit normal waren, haben die Ergebnisse gezeigt, dass die AMPK α2-abhängige Signalkaskade essentiell bei der Stabilisierung eines Thrombus ist. Und obwohl der Einfluss des AMPK-Signalwegs bei Diabetes noch nicht untersucht wurde, nehmen wir an, dass Fehler in der untersuchten Signalkaskade zu einer Destabilisierung von Blutgerinnseln und zu erhöhtem Auftreten von Embolien führt, was tatsächlich bei Diabetikern häufig festgestellt wurde.