Open Access

Julia Schiemann

• An exciting in vivo function of ATP-sensitive potassium channels in substantia nigra dopamine neurons Ð Implications for burst firing and novelty coding ÐPhasic burst activity is a key feature of dopamine (DA) midbrain neurons. This particular pattern of excitation of DA neurons occurs via a synaptically triggered transition from low-frequency background spiking to transient high-frequency discharges. Burst-firing mediated phasic DA release is critical for flexible switching of behavioural strategies in response to unexpected rewards, novelty and other salient stimuli. However, the cellular and molecular bases of burst signalling in distinct DA subpopulations of the substantia nigra (SN) or the ventral tegmental area (VTA) are unknown. DA neuron excitability is controlled by synaptic network inputs, neurotransmitter receptors and ion channels, which generate action potentials and determine frequency and pattern of electrical activity in a complex interplay. ATP-sensitive potassium (K-ATP) channels are widely expressed throughout the brain, where in most cases they are believed to act as metabolically-controlled 'excitation brakes' by matching excitability to cellular energy states. However, their precise physiological in vivo function in DA neurons remains elusive. To study burst firing and the underlying ionic mechanisms with single cell resolution, in vivo single-unit recordings were combined with juxtacellular neurobiotin labelling as well as immunohistochemical and anatomical identification of individual DA neurons. In vivo recordings were performed in adult isoflurane-anaesthetised wildtype (WT) and global K-ATP channel knockout mice, lacking the pore forming Kir6.2 subunit (Kir6.2-/-). In addition, DA cell-selective functional silencing of K-ATP channel activity in vivo was established using virus-mediated expression of dominant-negative Kir6.2 subunits. Careful control experiments ruled out any significant contributions from nonDA neurons as transduction was effectively limited to SN DA neurons rather than affecting those cells that innervate them. Virus-based K-ATP channel silencing in combination with juxtacellular recording and labelling was achieved to define the electrophysiological phenotype of individually identified, virally-transduced DA neurons in vivo. Single-unit recordings revealed that K-ATP channels Ð in contrast to their conventional hyperpolarising role Ð in a subpopulation of DA neurons located in the medial SN (m-SN) act as cell-type selective gates for excitatory burst firing in vivo. The percentage of spikes in bursts was threefold reduced in Kir6.2-/- compared to WT mice. Classification of firing patterns based on visual inspection of autocorrelation histograms and on a newly developed spike-train-model confirmed the dramatic shift from phasic burst to tonic single-spike oscillatory firing in Kir6.2-/-. This significant decrease of burstiness was selective for m-SN DA neurons and was not exhibited by DA cells in the lateral SN or VTA. Virus-based K-ATP channel silencing in vivo unequivocally demonstrated that the activity of postsynaptic K-ATP channels was sufficient to disrupt bursting in m-SN DA neuron subtypes. Patch-clamp recordings in brain slices indicated an essential role of K-ATP channels for NMDA-mediated in vitro bursting. In accordance with previous studies in DA midbrain neurons, NMDA receptor stimulation triggered burst-like firing in m-SN DA cells in vitro, but only when K-ATP channels were co-activated in these neurons. K-ATP channel-gated burst firing in m-SN DA neurons might be functionally relevant in awake, freely moving mice. To explore the behavioural consequences of SN DA neuron subtype-selective K-ATP channel suppression, spontaneous open field (OF) behaviour of mice with bilateral K-ATP silencing across the whole SN (medial + lateral) or in only the lateral SN was tested. Analysis of WT and global Kir6.2-/- mice showed reduced exploratory locomotor activity of Kir6.2-/- in a novel OF environment. Remarkably, K-ATP channel silencing in m-SN DA neurons phenocopied this novelty-exploration deficit, indicating that K-ATP channel-gated burst firing in medial but not lateral SN DA neurons is crucial for WT-like novelty-dependent exploratory behaviour. In summary, a novel role of K-ATP channels in promoting the excitatory switch from tonic to phasic firing in vivo in a cell-type specific manner was discovered. The present PhD thesis provides several important insights into the pivotal function of K-ATP channels in medial SN DA cells, which project to the dorsomedial striatum, for burst firing and its important consequences for context-dependent exploratory behaviour. In collaboration with two other research groups transcriptional up-regulation of K-ATP channel and NMDA receptor subunits and high levels of in vivo burst firing were detected in surviving SN DA neurons from Parkinson's disease (PD) patients Ð providing a potential link of K-ATP channel activity to neurodegenerative pathomechanisms of PD. Using high-resolution fMRI imaging another study in humans has recently identified distinct DA midbrain regions that are preferentially activated by either reward or novelty. Taken together, these human data and the results of the present PhD thesis suggest that burst-gating K-ATP channel function in SN DA neurons impacts on phenotypes in disease as well as in health.
• Seit seiner mit dem Nobelpreis gewürdigten Entdeckung in den 1950er Jahren wurde der Neurotransmitter Dopamin (DA) mit einer Vielzahl von physiologischen Gehirnfunktionen in Verbindung gebracht, wie z.B. Bewegungskontrolle, Motivation,Kodierung von belohnungsversprechenden oder neuen, unbekannten Reizen. Degeneration oder Funktionsstörungen des dopaminergen Mittelhirnsystems liegen den pathophysiologischen Symptomen der Parkinson Erkrankung sowie der Schizophrenie, Drogenabhängigkeit und dem Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndrom zu Grunde. Die elektrischen Aktivitätsmuster DA Zellen im intakten Netzwerk in vivo sind dynamisch; die tonische und phasische Signalkodierung stellen Schlüsselfunktionen des DA Systems dar. Insbesondere die phasische Aktivierung von DA Neuronen hat entscheidende Bedeutung für die flexible Anpassung von Verhaltensstrategien bei unerwarteten Belohnungen, neuartigen Stimuli oder generell bedeutsamen Ereignissen. Sie wird generiert durch eine synaptisch induzierte Umschaltung von tonischer Hintergrundaktivität (im Frequenzbereich von 4-6 Hz) zu transienten, schnelleren Entladungen (13-20 Hz) – sogenannten ‘Bursts’. Hochfrequente Aktionspotentialfolgen in den Bursts resultieren in erhöhter DA Freisetzung in den Projektionsgebieten des DA Systems und beeinflussen sensomotorische, limbische oder assoziative Funktionen des Basalgangliennetzwerks. In den verschiedenen DA Subpopulationen der Substantia Nigra (SN) und der Ventralen Tegmentalen Region (VTA) sind die zellulären und molekularen Grundlagen dieser zwei differentiellen neuronalen Aktivitätsmodi bisher weitestgehend unbekannt. Die Erregbarkeit der DA Neurone wird durch synaptische Netzwerkeingänge, Neurotransmitterrezeptoren und Ionenkanäle kontrolliert. In einem komplexen Zusammenspiel werden Aktionspotentiale generiert, sowie Entladungsfrequenz und Feuerungsmuster bestimmt. ATP-sensitive Kaliumkanäle (KATP Kanäle) sind in vielen erregbaren Zellen exprimiert und können aufgrund ihrer metabolischen Sensitivität die elektrische Aktivität an den Energiestatus der Zellen anpassen. Vereinfacht dargestellt wird der Kanal bei einem hohen Energieniveau durch ATP inhibiert und bei Abnahme der ATP-Konzentration und hohem Nährstoffverbrauch durch Mg-ADP aktiviert. In DA Neuronen ist die genaue physiologische in vivo Funktion von KATP Kanälen jedoch unklar. Um die zugrundeliegenden Mechanismen des phasischen Burstentladungsmusters in DA Subpopulationen zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit elektrophysiologische Einzelzellableitungen in vivo mit juxtazellulärer Neurobiotinmarkierung individueller Neurone kombiniert. Für die anschließende anatomische und immunhistologische Identifikation in vivo einzeln gemessener und Neurobiotingefüllter Neurone wurden die Markerproteine Tyrosinhydroxylase und Calbindin verwendet. Unter Isofluran-Anästhesie wurden SN und VTA DA Neurone in adulten C57BL/6N Wildtypmäusen (WT) sowie in transgenen Mäusen mit genetischer Deletion der porenbildenden Kir6.2 Untereinheit des KATP Kanals (Kir6.2-/-)analysiert. Darüberhinaus wurde die rAAV2 (rekombinante Adeno-assoziierte Viren Serotyp 2) vermittelte Transduktion und Expression einer dominant-negativen Kir6.2 Porenmutante (Kir6.2_DN) mit dem Ziel des zellselektiven Ausschaltens der KATP Kanalfunktion in WT DA Neuronen erfolgreich etabliert. Zur Kontrolle wurden native WT Kir6.2 Untereinheiten (Kir6.2_WT) eingesetzt und für den immunhistochemischen Nachweis war den Konstrukten eine kurze Peptidsequenz eines viralen Oberflächenantigens angehängt. Das in anderen Studien zum Transduktionsnachweis standardmäßig verwendete grünfluoreszierende Protein (GFP) veränderte in unspezifischer Weise die physiologische Burstaktivität von SN DA Neuronen in vivo. Mehrere Kontrollexperimente zeigten eine hohe Transduktionseffizienz und -selektivität der viral-kodierten Kir6.2 Proteine für DA Neurone, unspezifische Effekte nicht-dopaminerger Zelltypen durch lokale oder afferente Netzwerkeinflüsse konnten ausgeschlossen werden. Durch eine zuvor nicht beschriebene, neue Methodenkombination von juxtazellulärer Ableitung, Einzelzellmarkierung und funktioneller Inaktivierung von KATP Kanälen war es erstmals möglich, die elektrophysiologischen Eigenschaften einzeln identifizierter, viral-transduzierter SNDA Neurone in vivo zu definieren1. Die basalen elektrischen Eigenschaften wie Entladungsrate, Regularität undAktivitätsmuster waren generell ähnlich in den verschiedenen DA Subpopulationen innerhalb der SN und der VTA in WT Mäusen. Dagegen wurden signifikante Unterschiede der in vivo Intraburst-Eigenschaften festgestellt. Am auffälligsten war, dass einzelne Burstpakete in der lateralen SN signifikant mehr Aktionspotentiale umfassten als medial, was auf unterschiedliche Burstmechanismen in medialen (m-SN) und lateralen (l-SN) DA Zellgruppen schließen ließ. Die Untersuchung der axonalen Konnektivität durch retrograde Tracing-Experimente zeigte, dass DA Neurone der medialen SN mit dem dorsomedialen Striatum (DMS) in Verbindung stehen, wohingegen die laterale SN vorwiegend in dorsolaterale Regionen des Striatums (DLS) projiziert. Innerhalb der parallelen kortikostriatalen Verarbeitungsschleifen ist das DMS in die Koordination zielgerichteter Bewegungen und Verhaltensweisen eingebunden, dem DLS kommt eher eine Funktion bei habituellen Aktionen zu. In diesem Kontext ist eine funktionelle Spezialisierung der topographisch organisierten, afferenten Projektionen aus der SN plausibel. Zusätzlich zu dieser anatomischen Unterteilung können SN DA Neurone anhand ihrer neurochemischen Identität und der differentiellen Expression des calciumbindenden Proteins Calbindin unterschieden werden. Identifizierte Calbindinpositive SN DA Neurone im WT wiesen in vivo ein ungewöhnliches Aktivitätsprofil auf, das durch rhythmisch auftretende Burstentladungen charakterisiert war. Dieses oszillatorische Burstmuster wurde hier erstmals mit der Expression von Calbindin in Verbindung gebracht. In vivo Einzelzellableitungen in WT und Kir6.2-/- Mäusen ergaben, dass KATP Kanäle – im Gegensatz zu ihrer konventionellen inhibitorischen Funktion – in einer Subpopulation von DA Neuronen in der medialen SN exzitatorisch wirken und das Burstentladungsmuster verstärken. Der relative Anteil an Aktionspotentialen im Burstmodus war im Vergleich zum WT in Kir6.2-/- Mäusen um das Dreifache reduziert. Der deutliche Wechsel von phasischen Burst- zu oszillatorischen Einzelimpulsmustern in Kir6.2-/- wurde bestätigt durch Klassifikation der Aktivitätsprofile basierend auf qualitativer Analyse von Autokorrelationshistogrammen sowie auf einem neu entwickelten mathematischen Modell2. Die mittlere tonische Entladungsfrequenz war von der dramatischen Veränderung des Burstmodus nicht betroffen und identisch in den WT und Kir6.2-/- Gruppen. Zudem trat die signifikante Reduktion der Bursterregbarkeit selektiv in m-SN DA Subtypen auf und wurde dagegen nicht in identifizierten l-SN oder VTA DA Neuronen beobachtet. Elektrophysiologische Ableitungen synaptisch isolierter DA Zellen in Hirnschnittprä-paraten3 deuteten auf einen mechanistischen Beitrag von KATP Kanälen bei NMDA Rezeptor generierten Bursts hin. In Übereinstimmung mit bisherigen Arbeiten in DA Mittelhirnneuronen, löste die Stimulation von NMDA Rezeptoren in vitro burstartiges Feuern in WT m-SN DA Neuronen aus, allerdings nur bei gleichzeitiger pharmakologischer Koaktivierung von KATP Kanälen. Aufgrund des Fehlens funktioneller KATP Kanäle konnten in m-SN DA Neuronen des Kir6.2-/- Stammes durch NMDA Applikation in vitro keine Bursts induziert werden. Mittels der neu etablierten, Virus-vermittelten selektiven Suppression von KATP Kanälen konnte der Beweis erbracht werden, dass die beobachtete Burstabnahme nicht auf einem Netzwerkeffekt beruht, sondern die Funktion postsynaptischer KATP Kanäle in m-SN DA Zellen notwendig für deren phasische in vivo Aktivität ist. Die Expression der dominant-negativen Porenmutante Kir6.2_DN in m-SN DA Neuronen inhibierte die Burstentladungen im ansonsten intakten Netzwerk. Analog zu den Befunden in Kir6.2-/- Mäusen waren der relative Burstanteil sowie die Häufigkeit phasischer Aktivitätsmuster signifikant erniedrigt im Vergleich zum SN DA Neuronen der Kir6.2_WT exprimierenden Kontrollgruppe. Die KATP Kanal abhängige Burstaktivität in der medialen SN hat möglicherweise verhaltensrelevante Konsequenzen in wachen Tieren. Um die spontane Lokomotion und Exploration von WT, Kir6.2-/- und Virus-injizierten Mäusen zu untersuchen, wurden Verhaltenstests im Offenfeld (OF) durchgeführt4. Der Vergleich von WT und globalen Kir6.2-/- Mäusen zeigte eine signifikant verringerte horizontale Lokomotion in der initialen Phase bei Konfrontation mit der neuen, unbekannten OF Umgebung in Kir6.2-/-. Die aktive Exploration im dreidimensionalen Raum durch das Aufrichten der Tiere (Rearing) war in Kir6.2-/- verglichen mit WT Mäusen über den gesamten Testzeitraum reduziert. Um darüberhinaus die funktionellen Effekte der subtypspezifischen KATP Kanal-Inaktivierung in SN DA Neuronen auf das Explorationsverhalten zu definieren, wurden KATP Kanäle entweder in der gesamten SN (medial + lateral) oder limitiert auf die laterale SN durch selektive virale Injektion und Expression der Kir6.2_DN Porenmutante stillgelegt. Das Abschalten von KATP Kanälen in m- und l-SN DA Neuronen war ausreichend, um das Verhalten Virus-injizierter Mäuse zu verändern und resultierte in einem Neuigkeits-Explorations-Defizit, ähnlich zu den Beobachtungen in globalen Kir6.2-/- Tieren. Die initiale Lokomotion sowie das Rearing waren signifikant erniedrigtim Vergleich zu Mäusen mit selektiver l-SN Kontrollinjektion, deren Verhalten unverändert und identisch zum WT war. Um eine mögliche angstbedingte Inhibition der motorischen Aktivität zu vermeiden, wurden neutrale, nicht-aversive OF Bedingungen gewählt. Die Analyse angstrelevanter Verhaltensparameter ergab keinen Unterschied zwischen den zwei Virus-injizierten Testgruppen. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass KATP Kanal abhängige phasische Burstaktivität in medialen, aber nicht in lateralen SN DA Neuronen entscheidend für das normale Wildtyp-Explorationsverhalten ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde eine neue, zelltypspezifische Funktion von KATP Kanälen entdeckt. KATP Kanäle steuern in medialen SN DA Neuronen, die in das dorsomediale Striatum projizieren, in vivo das Umschalten von tonischer zu phasischer Aktivität. In vitro konnte gezeigt werden, dass in diesen Zellen die Koaktivierung von KATP Kanälen eine essentielle Rolle für NMDA Rezeptor-induzierte Bursts spielt. Die in anderen Studien beschriebene, für die NMDA-Burstinduktion in DA Neuronen notwendige hyperpolarisierende Stromkomponente wird möglicherweise von KATP Kanälen getragen. Mechanistisch ist eine metabolische Kopplung über gesteigerten ATP Verbrauch bzw. erhöhte ADP Erzeugung während hochfrequenter Burstaktivität in Submembran-Domänen durch Natriumeinstrom, die Aktivierung der Na+-K+-ATPase und Rekrutierung von KATP Kanälen denkbar. Eine KATP -vermittelte Hyperpolarisation könnte die Erholung von Natrium- und Calciumkanälen aus der Inaktivierung beschleunigen und somit die zelluläre Erregbarkeit von SN DA Zellen für exzitatorische synaptische Eingänge aus dem Basalgangliennetzwerk steigern. Die genauen Mechanismen der differentiellen Burstkontrolle in medialen (KATP -abhängige Bursts) und lateralen (KATP -unabhängige Bursts) SN DA Neuronen sowie die intrazellulären Signalkaskaden zur dynamischen und physiologischen Aktivierung von KATP Kanälen in vivo müssen in weiterführenden Studien aufgeklärt werden. Hochfrequente Burstentladungen des DA Systems kodieren verhaltensrelevante Informationen wie Belohnungs- oder Neuigkeitssignale. In Übereinstimmung damit resultierte eine – in der vorliegenden Arbeit durch selektive virale Inaktivierung von KATP Kanälen erzielte – geringe in vivo Burstaktivität in m-SN DA Neuronen bei Mäusen in einem Neuigkeits-Explorations-Defizit. Mittels hochauflösenden bildgebenden Verfahren zeigte eine andere Studie kürzlich im Menschen die damit konsistente differentielle Aktivierung verschiedener VTA/SN Regionen durch belohnungskodierende oder neuartige, unbekannte Stimuli. Darüberhinaus lieferte die direkte Zusammenarbeit mit zwei weiteren Forschergruppen Hinweise auf eine transkriptionelle Dysregulation von KATP Kanaluntereinheiten5 sowie einen hohen Anteil an Burstentladungsmustern in vivo6 in überlebenden humanen nigrostriatalen DA Neuronen von Parkinson Patienten. Zusammen mit der selektiven Aktivierung von KATP Kanälen in vulnerablen SN DA Neuronen durch oxidativen Stress, die in einer früher publizierten Arbeit unserer Gruppe gezeigt wurde, deuten diese Ergebnisse eine mögliche Rolle von KATP Kanälen im Pathomechanismus dieser neurodegenerativen Erkrankung an. Die beobachteten zellspezifischen Veränderungen könnten eine burstaktivitätsbedingte Übererregbarkeit (‘stressful bursting’ ) oder alternativ eine kompensatorische, homeostatische Adaptation des DA Systems im Krankheitsprozess widerspiegeln. Im Kontext der funktionellen Daten dieses Dissertationsprojektes kann somit ein entscheidender Einfluss der durch KATP Kanäle in vivo vermittelten Burst-Exzitation sowohl auf physiologische zelluläre und verhaltensrelevante Funktionenals auch auf potentiell pathophysiologische Charakteristika von SN DA Neuronen definiert werden.