Open Access

Juliane Mooz

• The RAF family of kinases constitutes the members A, B and CRAF. They mediate RAS signaling by linking it to the MEK/ERK transduction module, which regulates cellular processes such as cell proliferation, migration, survival and cell death. As the RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK) pathway is found to be activated in human cancers, the RAF kinases have been exploited as valuable therapeutic targets and RAF inhibitors show promising results in the clinic, esp. with tumors harboring an activating BRAFV600E mutation. However, RAF inhibitors paradoxically accelerate metastasis in RAS mutant and BRAF wildtype tumors. They also become ineffective over time in BRAFV600E tumors because of reactivation of downstream mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling by promoting RAF dimerization. Aims of the present work were 1) to investigate the role of ARAF kinase in the paradoxical activation of the enzymatic cascade by RAF inhibitors downstream of mutated RAS and 2) to study the consequences of the loss of ARAF function on signal transduction in vitro and in vivo (nude mice). We have engineered several cell lines that would allow the study of basal and RAF inhibitor induced effects on MAPK activation, tumor cell migration and invasion. In summary, we were able to show that the RAF isoform ARAF has an obligatory role in promoting MAPK activity and tumor cell invasion in a cell type dependent manner. In these cell types, ARAF depletion prevented the activation of MAPK kinase 1 (MEK1) and extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) and led to a significant decrease of protrusions growing out of tumor cell spheroids in a three-dimensional (3D) culture that were otherwise induced by BRAFV600E-specific or BRAF/CRAF inhibitors (GDC-0879 and sorafenib, respectively). RAF inhibitors stimulated homodimerization of ARAF and heteromerization of BRAF with CRAF and the scaffolding protein KSR1. However, induced oligomerization was not sufficient to activate MAPK signaling if ARAF was depleted. By employing full length recombinant kinases, we were able to show for the first time that the three RAF isoforms competed for the binding to MEK1. In cell culture models, the overexpression of dimer-deficient ARAF mutants impaired the interaction between ARAF and endogenous MEK1 and thus prevented the subsequent phosphorylation of MEK1 and ERK1/2. Our findings reveal a new role for ARAF in directly activating the MAPK cascade through homodimerization and thereby promoting tumor cell invasion, suggesting the conserved RAF-dimer interface as a target for RAS- and RAF mediated cancer therapy. Collectively, we provide evidence for the dual role ARAF plays in controlling MAPK signaling and cancer as loss of ARAF promoted strong lung metastasis formation in nude mice. Preliminary data describing the underlying mechanisms behind ARAF-regulated metastases have been presented and discussed.
• Prozesse wie Wachstum, Vermehrung, Überleben und Sterben von Zellen werden durch RAS-Proteine gesteuert, die mit Hilfe von RAF-Proteinkinasen extrazelluläre Signale über MEK und ERK-kinasen ins Zellinnere weiterleiten (MAPK- Signalweg). Diese so genannte RAS/RAF/MEK/ERK-Kaskade ist in vielen menschlichen Krebsarten (hyper)aktiviert. Die humane Familie der RAF-Proteine setzt sich aus den Serin/ Threoninkinasen A, B und CRAF zusammen, denen RAS als Aktivator und MEK als Substrat gemein ist. Während BRAF bereits durch die Bindung an RAS aktiviert wird, sind für die Aktivierung von ARAF und CRAF weitere Faktoren erforderlich. Hierin liegt auch die Ursache für das ungebremste Zellwachstum, welches durch die häufigste Mutation im BRAF-Protein, die BRAF-V600E-Mutation, hervorgerufen wird. Dieser Aminosäureaustausch führt zur andauernden Aktivierung des MAPK-Signalweges und so in bestimmten Fällen, zu aggressiven Karzinomen (meist Melanomen). RAF-Kinasen stellen deshalb ein vielversprechendes Ziel in der Behandlung von Tumoren dar (besonders Tumore mit zugrunde liegender aktivierender BRAF-V600E Mutation). Krebstherapien zielen darauf ab, die hyperaktivierten Kinasen zu hemmen und somit das Tumorwachstum zu unterbinden. Dabei werden unterschiedlich selektive RAF-Inhibitoren (small molecules) in der Behandlung von Patienten eingesetzt. Spezifische BRAF-V600E-Blocker konnten das progressionsfreie Überleben, sowie das Gesamtüberleben von Patienten mit metastasiertem Melanom im Vergleich zur Chemotherapie deutlich verbessern. Dennoch beschleunigen RAF-Inhibitoren das Wachstum von Metastasen in RAS mutierten Tumoren und werden mit der Zeit aufgrund von Reaktivierung des MAPK Signalweges, auch unwirksam in Tumoren, in denen sie zuvor effektiv (BRAF-V600E) waren. Die Ziele der hier vorliegenden Arbeit waren im Einzelnen 1) die Ermittlung des Zusammenhangs zwischen ARAF-Funktionsweise und der paradoxen Aktivierung der MAPK-Signalkaskade durch RAF-Inhibitoren in RAS mutierten Zellinien sowie 2) die Untersuchung der Auswirkungen auf den MAPK-Signalweg bei Verlust von ARAF-Expremierung so wohl in vitro als auch in vivo (Nacktmäuse). Die dazu verwendeten Zellinien wurden so verändert, dass wichtige Prozesse der Krebsentstehung wie MAPK-Aktivierung, Tumorzellmigration und- invasion zeitgleich untersucht werden konnten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Proteinkinase ARAF bei der Aktivierung des klassischen MAPK-Signalwegs und der zelltyp- abhängigen Migration von Krebszellen unerlässlich ist. Die Herabsetzung der ARAF-Expression verhinderte sowohl die Phosphorylierung von MAPK-Kinase 1 (MEK1) als auch ihrem Substrat Extracellular Signal-regulated Kinase (ERK1/2). Darüber hinaus waren unter diesen Umständen weniger Auswüchse aus einem dreidimensionalen Tumorgewebe zu beobachten als es die Behandlung mit BRAFV600E- spezifischen oder pan-RAF-Inhibitoren (GDC-0879 oder Sorafenib) normalerweise in diesen Zellen bewirkt. Die verwendeten RAF-Inhibitoren führten zur Bildung von ARAF-Homodimeren sowie zur Oligomerisation anderer RAF-Kinasen mit dem Stützprotein KSR 1. Auch bei verminderter ARAF-Expression bildeten sich die eben beschriebenen Signal-Komplexe, welche jedoch nicht (ausreichend) aktiv waren, um die MAPK-Kaskade und die damit verbundene Migration der Tumorzellen, in Gang zu setzen. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass die drei rekombinanten RAF-Isoformen in einer aufgereinigten Proteinläsung miteinander um die Bindung an ihr Substrat MEK 1 konkurrierten. Zellkulturexperimente bewiesen zudem, dass ARAF-Mutanten, die nicht in der Lage waren sich zu Dimeren zusammenzulagern, auch nicht ihr zelluläres Substrat MEK 1 binden konnten und es als Folge zu keiner nachgeschalteten Phosphorylierung kam. Unsere Ergebnisse beschreiben die vielfältige Funktionsweise der ARAF-Proteinkinase wenn es um die zellinterne Signalübertragung (Aktivierung des MAPK-Signalwegs) und die sich daraus ableitende Invasierung von Tumorzellen geht. Damit stellt die vormals wenig bedeutsame Serin/ Threoninkinase ARAF eine neuartige Option in der Behandlung bösartiger Tumore dar, welche auf mutiertes RAS und/ oder RAF zurückzuführen sind. Die vorliegenden Untersuchungen weisen ARAF einerseits als Onkogen aus, andererseits führte der Expressionsverlust von ARAF bei der Injektion solcher Zellen in die Schwanzvene von Nacktmäusen zu starker Metastasenbildung in der Lunge der Tiere, was auf eine protektive Funktion der ARAF-Kinase schließen läßt. Bis zum heutigen Zeitpunkt konnten wir mittels Vergleichsstudien erste aufregende Erkenntnisse über die Ursachen dieser unerwarteten ARAF-Doppelfunktion als Tumorsuppressor/ aktivator gewinnen, welche den Anfang eines neuen spannenden Kapitels in der mittlerweile schon über 40- jährigen RAF-Geschichte bilden kšnnten.