Open Access

Barbara Schenk

• Necroptosis is a programmed cell death pathway that is implicated in a variety of human diseases. In recent years, increasing knowledge has been gained on the necroptotic signaling cascade. Nevertheless, the role of reactive oxygen species (ROS) in necroptosis is still ambiguous. In this study, we reveal that ROS critically regulate BV6/TNFα-induced necroptotic signaling in FADD-deficient Jurkat cells and in zVAD-treated MV4-11 cells. We show that several ROS scavengers such as butylated hydroxyanisole (BHA), N-acetylcysteine (NAC), α-tocopherol (αToc) and ethyl pyruvate (EP) significantly reduce ROS production and BV6/TNFα–induced cell death. Importantly, ROS are produced prior to cell death induction and promote the assembly of the Receptor-interacting protein kinase (RIP)1/RIP3 necrosome complex via a potential positive feedback loop since on the one hand radical scavengers diminish RIP1/RIP3 necrosome formation and since on the other hand RIP1 or RIP3 silencing attenuates ROS production. Furthermore, the deubiquitinase CYLD contributes to BV6/TNFα-induced ROS generation, necrosome assembly and cell death since CYLD knockdown attenuates all these events. Of note, knockdown of the downstream effector protein mixed lineage kinase domain like (MLKL) only partly reduces BV6/TNFα-triggered ROS production and cell death and does not affect necrosome formation. Contrary to expectations, the MLKL inhibitor Necrosulfonamide (NSA) not only decreases BV6/TNFα-stimulated ROS production and cell death but also attenuates RIP1/RIP3 necrosome assembly pointing to additional and MLKL-independent anti-necroptotic effects of NSA. Interestingly, silencing of the potential necroptotic excecutors mitochondrial proteins phosphoglycerate mutase family member 5 (PGAM5) or Dynamin-related protein 1 (Drp1) does not affect BV6/TNFα-induced cell death. Consistently, mitochondrial perturbations are not implicated in BV6/TNFα-induced cell death since mitochondrial membrane potential and respiration remain stable along with to BV6/TNFα-triggered necroptosis induction. Interference with the mitochondrial potential by depolarizing agents such as FCCP reduces BV6/TNFα-induced necroptosis indicating that proper mitochondrial function or a well-defined redox status is required for necroptotic cell death execution. This study demonstrates that ROS are critically involved in BV6/TNFα-induced necroptosis and thus provides novel insights into the redox regulation of necroptotic signaling.
• Programmierte Zelltodmechanismen sind wesentlich an der Regulation des zellulären Gleichgewichts beteiligt. Alternativ zur klassischen Apoptose können Zellen auch über die sogenannte Nekroptose sterben. Bei der Nekroptose handelt es sich um einen regulierten Zelltodmechanismus, der nekrotische Charakteristika, wie die Ruptur der Plasmamembran, aufweist. Zur Induktion der Nekroptose kommt es vor allem dann, wenn die Aktivierung von Caspasen durch Inhibitoren wie zVAD oder durch genetische Defizienz von Caspase-8 oder Fas-associated death domain (FADD) unterbunden wird. Sie dient daher als eine Art Backup-System, wenn die apoptotische Maschinerie zum Beispiel aufgrund von Mutationen oder einer pathogenen Infektion nicht funktionsfähig ist. Die Nekroptose verläuft im Gegensatz zur Apoptose ohne die Aktivierung von Caspasen und wird hauptsächlich von den Receptor interacting protein Kinasen RIP1 und RIP3 reguliert, welche nach Aktivierung den RIP1/RIP3 Nekrosomkomplex ausbilden. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen des nekroptotischen Signalwegs gewonnen. So konnte die Pseudokinase mixed lineage kinase domain like (MLKL) als das nekroptotische Schlüsselprotein nach dem RIP1/RIP3 Nekrosom identifiziert werden. MLKL wird von RIP3 phosphoryliert und aktiviert, woraufhin sich MLKL-Oligomere ausbilden, die zur Plasmamembran translozieren und dort Poren formen, durch welche zum Beispiel Calcium- und Kaliumionen in das Zytosol eindringen und durch welche es auch letztlich zur Plasmamembranruptur kommt. Darüber hinaus wurden kürzlich die mitochondrialen Proteine phosphoglycerate mutase family member 5 (PGAM5) und Dynamin related protein 1 (Drp1) als Effektorproteine der Nekroptose beschrieben. Die Nekroptose kann über diverse Stimuli aktiviert werden, wobei der Tumor Nekrose Faktor α (TNFα)-induzierte Membranrezeptor-vermittelte Signalweg am besten erforscht ist. Zudem können sogenannte Smac Mimetika die Nekroptose auslösen. Smac Mimetika wie BV6 führen zur Autoubiquitinierung und damit zum proteasomalen Abbau von cellular Inhibitor of apoptosis (cIAP) Proteinen. Durch das Fehlen von IAP Proteinen kommt es zu einer erhöhten Deubiquitinierung von RIP1 und daher zu einer erleichterten Bildung des RIP1/RIP3 Nekrosoms. Reaktive Sauerstoffspezies (engl. Reactive oxygen species = ROS) wurden in einer Vielzahl von Studien mit dem nekroptotischen Zelltod in Verbindung gebracht. Trotz jahrelanger Forschung ist jedoch noch nicht eindeutig geklärt, ob die ROS-Produktion tatsächlich für die Einleitung der Nekroptose notwendig ist. Da es sich bei ROS sowohl um zerstörerische als auch um regulatorische Moleküle der Signaltransduktion handeln kann, steht die Untersuchung der Rolle von ROS in der Nekroptose im Mittelpunkt dieser Arbeit...