Open Access

Ines Eckhardt

• Since Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are frequently dysregulated in different cancer entities and contribute to apoptosis resistance, pharmacological IAP antagonists are considered to be promising agents for the future development of cancer treatment strategies. IAP antagonists are small-molecule drugs that have been designed to mimic the interaction site of IAP proteins with their endogenous inhibitor Second mitochondrial activator of caspases (SMAC). Thus, they are frequently referred to as SMAC mimetics. Treatment with SMAC mimetics engages an apoptotic program in cancers by affecting different components of the apoptotic machinery. Besides disinhibition of caspases, SMAC mimetics trigger non-canonical nuclear factor-κB (NF-κB) signaling, which induces upregulation of tumor necrosis factor (TNF) α and other NF-κB target genes. In particular, TNFα production has been closely linked to the induction of SMAC mimetic-mediated cell death. The TNFα-dependent para/autocrine loop facilitates the formation of a cytosolic complex consisting of caspase-8, Fas-associated death domain (FADD) and Receptor-interacting protein (RIP) 1, which serves as caspase-8 activation platform and ultimately triggers induction of apoptosis. In the present study, we use the small-molecule bivalent SMAC mimetic BV6 to analyze SMAC-stimulated NF-κB signaling in cancer cell lines of different entities. Interestingly, we identify two novel NF-κB-regulated factors that are both required for SMAC mimetic-induced apoptosis in a context-dependent manner. First, we show that NF-κB-dependent upregulation of death receptor 5 (DR5) can serve as an alternative mechanism of BV6-mediated cell death. We demonstrate that BV6 treatment induces NF-κB-dependent but largely TNFα -independent apoptosis in A172 glioblastoma cells. By using an unbiased whole genome expression analysis approach, we identify DR5 as a critical NF-κB target gene, which substitutes TNFα and is indispensable for BV6-initated cell death in A172 cells. Second, we demonstrate that Interferon regulatory factor (IRF) 1 is required for BV6-induced TNFα production and apoptosis. Our study provides evidence that IRF1 closely cooperates with the NF-κB network in BV6-mediated cell death and additionally alters expression of selective SMAC mimetic-induced target genes. Furthermore, we show that BV6 treatment triggers secretion of a set of proinflammatory cytokines and increases attraction of monocytes to BV6-treated tumor cells in an IRF1-dependent manner. In summary, our work supports the notion that NF-κB-regulated factors are critically required for SMAC mimetic-initiated apoptosis. We show that IRF1 is indispensable for TNFα production and cell death in BV6-sensitive cell lines and that also DR5 can serve as a proapoptotic NF-κB-controlled factor in BV6-induced apoptosis besides TNFα. Furthermore, this study contributes to an improved understanding on non-apoptotic functions of SMAC mimetics, as IRF1 additionally influences expression levels of proinflammatory cytokines and attraction of immune cells. Thus, our work provides novel insights into the regulation of SMAC mimetic-induced signaling events, which is crucial for the translation of SMAC mimetics for use in clinical application.
• Inhibitor of apoptosis (IAP) Proteine gelten als vielversprechende Angriffspunkte für die weitere Entwicklung aktueller Therapien zur Behandlung von Krebserkrankungen. Sie sind häufig in hohem Maße in Krebszellen exprimiert und können dort zur Apoptoseresistenz beitragen. Die Klasse der IAP Proteine beinhaltet neun Familienmitglieder, die sich alle durch das Vorhandensein mindestens einer baculovirus IAP repeat (BIR) Domäne auszeichnen, welche maßgeblich an der Entstehung von Protein-Protein Interaktionen beteiligt sind. Die IAP Proteine sind potente Inhibitoren des programmierten Zelltodes Apopotose, regulieren und modulieren aber gleichermaßen viele verschiedene Signalwege. X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) kann Caspasen durch direkte Bindung inhibieren indem es deren Oligomerisierung und Aktivierung inhibiert. Weiterhin besitzen einige IAP Familienmitglieder eine C-terminale really interesting new gene (RING) Domäne die ihnen E3 Ligase Aktivität verleiht. Insbesondere cellular inhibitor of apoptosis proteins (cIAP) können durch Ubiquitinierung verschiedener Protein deren Aktivität und Stabilität regulieren. Die Modulation des nuclear factor-κB (NF-κB) Signalwegs durch cIAPs ist von besonderer Relevanz für diese Arbeit. Der NF-κB Signalweg kann prinzipiell in zwei verschiedene Äste unterteilt werden: der kanonische und der nicht-kanonische NF-κB Signalweg. Im kanonischen Signalweg werden inaktive NF-κB Dimere aus p65 und p50 durch die Bindung der Inhibitor of NF-κB (IκB) Proteine im Cytosol sequestriert. Stimulation verschiedener Rezeptorsysteme, bspw. des tumor necrosis factor receptors (TNFR) oder das Auftreten intrazellulärer Initiatoren, bspw. DNA Schaden, führen zur Aktivierung eines trimeren Inhibitor of NF-κB Kinase (IKK) Komplexes, welcher IκB durch Phosphorylierung für anschließende proteasomale Degradation markiert. Dadurch werden p65/p50 Dimere frei und können im Nukleus die Aktivierung ihrer Zielgene initiieren. cIAP Proteine sind insbesondere für die TNFR1-stimulierte Aktivierung des kanonischen NF-κB Signalwegs von großer Bedeutung. Durch nicht degradierend wirkende K63-verlinkte Ubiquitinierung der Rezeptor-assoziierten Kinase receptor associated protein 1 (RIP1) stimulieren sie Rekrutierung und Aktivierung des IKK Komplexes und sind deswegen unerlässlich für TNF-stimulierte NF-κB Aktivierung. In der Regulation des nicht-kanonischen NF-κB Signalwegs spielen cIAP Proteine eine entgegengesetzte Rolle. Der zentrale Mediator des nicht-kanonischen NF-κB Signalweg ist die instabile NF-κB inducing kinase (NIK). In ruhenden Zellen wird NIK permanent durch einen trimeren Komplex aus cIAP1, TNF receptor associated factor (TRAF) 2 und TRAF3 für die proteasomale Degradierung markiert. Nach Rezeptorstimulation einer kleinen Gruppe spezifischer Rezeptoren zerfällt dieser Komplex und NIK akkumuliert und wird aktiviert. NIK Aktivität führt zur Phosphorylierung von IKKα und anschließender proteasomaler Prozessierung der inaktiven Proform p100 in die aktive Transkriptionsfaktorform p52. Aktive p52/RelB NF-κB Dimere können daraufhin Zielgene im Nukleus aktivieren. Zusammenfassend zeigt sich, dass IAP Proteine Apoptose direkt durch Caspasenblockierung hemmen können oder alternativ durch Regulation von NF-κB Signalwegen das zelluläre Programm modulieren. Um IAP Proteine in Krebszellen zu hemmen wurden synthetische IAP Inhibitoren entwickelt. Induktion von Apoptose beinhaltet den Verlust der Integrität mitochondrialer Membranen was u.A. bewirkt, dass das mitochondriale Protein Second mitochondrial activator of caspases (SMAC) frei wird. Dieses dient als endogener Inhibitor der IAP Proteine durch Interaktion eines tetrapeptidischen AVPI-Motivs (Ala-Val-Pro-Ile) mit den BIR Domänen der IAP Proteine. Synthetische IAP Inhibitoren wurden nach Vorbild dieses Motivs entwickelt und werden deshalb auch häufig als SMAC Mimetika bezeichnet. Bindung von SMAC Mimetika und cIAP Proteinen führt zu einer Konformationsänderung von cIAPs, die kurzzeitig deren E3 Ligase Aktivität stimuliert, letztendlich aber in deren Autoubiquitinierung und anschließender proteasomaler Degradation resultiert. Neben der Aufhebung der Caspaseninhibition wurde gezeigt, dass SMAC Mimetika durch Aktivierung des nicht kanonischen NF-κB Signalwegs eine para- bzw. autokrine TNFα Rückkopplungsschleife induzieren, die maßgeblich an der Zelltodinduktion beteiligt ist. Da cIAP Proteine unter diesen Bedingungen depletiert sind, kann RIP1 nicht ubiquitiniert werden und kanonische TNFα-vermittelte NF-κB Aktivierung wird inhibiert. Stattdessen stimuliert autokrines TNFα Aktivierung von Caspase-8 in einem trimeren Komplex aus Caspase-8, RIP1 und Fas-associated death domain (FADD) der final Apoptose einleitet. In dieser Arbeit wurde das SMAC Mimetika BV6 verwendet um dessen Wirkmechanismus in verschiedenen Krebszelllinien zu untersuchen. In der vorliegenden Studie haben wir zwei verschiedene Aspekte des BV6-vermittelten Wirkmechanismus adressiert: Erstens haben wir mittels einer genomweiten Transkriptomanalyse death receptor 5 (DR5) als weiteren NF-κB-regulierten Faktor identifiziert, der anstelle von TNFα BV6-vermittelten Zelltod initiieren kann (Teil I). Zweitens untersuchten wir die transkriptionelle TNFα Antwort nach BV6 Stimulation und konnten IRF1 als kritischen Faktor für den BV6-initiierten Anstieg in TNFα identifizieren. Im Zuge dessen konnten wir zeigen, dass IRF1 zusätzlich die Induktion einiger proinflammatorischer Zytokine und Rekrutierung von Monozyten zu Tumorzellen beeinflussen kann (Teil II)...