Open Access

Lunda Gu

• The ability of endothelial cells to properly adapt to changes in a dynamic blood perfused environment is essential to maintain the physiological function of the vascular system and of the organs. Epigenetic control of gene expression is believed to be the mechanism controlling cell-fate determination and cell-phenotype maintenance. In the thesis, two JmjC demethylases were screened for their function in endothelial biology. Both of them were proved to play a central role in angiogenesis. The histone 3 lysine 4 demethylase JARID1B was identified as the most highly expressed demethylase in endothelial cell. Knockdown of JARID1B in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) attenuated cell migration, angiogenic sprouting and tube formation. Jarid1b null mice exhibited attenuated retinal angiogenesis and reduced endothelial sprout outgrowth from aortic segments. Microarray data identified that the antiangiogenic transcription factor HOXA5 was suppressed by JARID1B. Consistently, chromatin immunoprecipitation experiment revealed that JARID1B occupies and reduces the histone 3 lysine 4 methylation levels at the HOXA5 promoter, demonstrating a direct function of JARID1B in endothelial HOXA5 gene regulation. Hence, as a highly expressed JmjC protein in endothelial cells, JARID1B fundamentally maintains endothelial angiogenic phenotypes perhaps through suppression of HOXA5. As second enzyme it was identified that the histone plant homeodomain finger protein 8 (PHF8) plays a role in endothelial angiogenic sprouting as well as tube formation and cell migration. Overexpression of PHF8 catalyzed the removal of methyl-groups from histone 3 lysine 9 (H3K9) and H4K20, whereas knockdown of the enzyme increased H3K9 methylation. Knockdown of PHF8 by RNAi also attenuated endothelial proliferation and survival. To characterize the underlying mechanism, E2F transcription factors were screened, which led to the identification of the gene repressor E2F4 to be controlled by PHF8. Importantly, PHF8 maintains E2F4, but not E2F1, expression in endothelial cells. Likewise, chromatin immunoprecipitation revealed that PHF8 reduces the H3K9me2 level at the E2F4 transcriptional start site, demonstrating a direct function of PHF8 in endothelial E2F4 gene regulation. Thus, it is proposed that PHF8 maintains endothelial function by controlling E2F4 expression. On the other hand, microarray and subsequent qPCR validation revealed that the expressions of small nuclear RNAs (snRNAs) were regulated by PHF8. Co-immunoprecipitation experiment demonstrated that PHF8 interacts with spliceosome related proteins SNRP70 and SRPK1 as well as snRNA. Indeed, PHF8 contributed to splicing: GLS and VEGF-A displayed alternative splicing in PHF8 depleted cells. In addition, c-FOS introns were showed to be retained after knockdown of PHF8 in endothelial cells. These results demonstrated that, by controlling angiogenic mRNA splicing, PHF8 could affect endothelial properties. Collectively, the results uncover the important roles of JARID1B and PHF8 in endothelial cells in the control of angiogenesis. Changing histone modifiers appears as an attractive concept for pro- and antiangiogenic therapy. The present work adds JARID1B and PHF8 as novel potential targets to this emerging field.
• Die besondere Fähigkeit von Endothelzellen sich den dynamischen Veränderungen der Umgebung des Blutkreislaufes anzupassen ist essentiell, um die physiologische Funktion des vaskulären Systems und der Organe aufrecht zu erhalten. Die epigenetische Kontrolle von differenzieller Genexpression wird als Mechanismus in der Festlegung des Zellschicksals und der Erhaltung des Zellphänotyps angesehen. In dieser Arbeit wurden die zwei Histondemethylasen JARID1B und PHF8 in einem Screening ausgewählt, um ihre Funktion in der Endothelzellbiologie zu untersuchen. Für beide Demethylasen wurde gezeigt, dass sie eine essentielle Rolle bei der Regulation der Angiogenese spielen. Zunächst wurden die Transkriptionslevel der Jumonji-domain-containing (JmjC) Demethylasen in Endothelzellen mit einem Affymetrix-Microarray und mittels RT-qPCR-Validierung ermittelt. Die Histon 3 Lysin 4 Demethylase JARID1B wurde als die in Endothelzellen am höchsten exprimierte JmjC-Demethylase identifiziert. Funktionsverlust-Studien mittels RNAi von JARID1B in Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) verminderten die endotheliale angiogene Kapazität bei der Bildung von Sphäroid-Auswüchsen und bei der Bildung von kapillar-ähnlichen Strukturen. Um diese Befunde im physiologischen Kontext zu bestätigen, wurden tamoxifen-induzierbare globale Knockout-Mäuse generiert, in denen die Depletion des Exons 6 zu einer Mutation mit einer Frame-Verschiebung führt. Die Aktivierung der Cre-Rekombinase durch Tamoxifen führte zu einem signifikanten Verlust von JARID1B auf Proteinebene in verschiedenen Geweben. Es wurde mittels qRT-PCR bestätigt, dass die Aktivierung der Cre-Rekombinase die Expression von JARID1B um etwa 80% in der Lunge reduzierte. Zehn Wochen alte Mäuse mit einem induzierten Knockout von JARID1B waren vital und zeigten keinen offensichtlichen Phänotyp im Erscheinungsbild. Der Aussprossung von Endothelzellen, detektiert anhand der Anzahl der CD31-positiven Zellen, war vermindert in explantierten Aortenringen: Beides, Spross-Anzahl und absolute Spross-Länge waren signifikant vermindert in Aortenringen von JARID1B Knockout-Mäusen. JARID1B beeinflusste die Physiologie der Angiogenese, da sowohl die Rate der retinalen Vaskularisierung als auch die Dichte des entwickelten vaskulären Plexus in Mäusen mit postnatalem Knockdown vermindert war. Zellen aus dem Knochenmark und Zellen, die bei der neuronalen Entwicklung beteiligt sind, könnten am Angiogeneseprozess potenziell involviert sein. Um diesen Einfluss auszuschließen, wurden die Versuche mit Tamoxifen induzierbaren Endothel-spezifischen JARID1B Knockout-Mäusen (Cdh5-Cre-Jarid1bF/F) wiederholt. In diesen Tieren war JARID1B spezifisch in Endothelzellen vermindert und der Phänotyp des verminderten retinalen vaskulären Wachstums und der verminderten vaskulären Dichte des Plexus wurde reproduziert. ... In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Histondemethylasen JARID1B und PHF8 in essentiellen Funktionen in Endothelzellen aufgezeigt. Das Verständnis der bisher wenig untersuchten epigenetischen Regulation in Endothelzellen wurde erweitert und neue Funktionen von JmjC-Histondemethylasen aufgedeckt. Es konnte gezeigt werden, dass die epigenetische Kontrolle ein zentraler Mechanismus in der Vaskulären Biologie darstellt und seine Störung die Endothelzellfunktion beeinträchtigt und damit als potentieller pharmakologischer Angriffspunkt fungieren kann.