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Tobias Bidon

• The mammalian family of bears (Ursidae) comprises eight extant species, occurring on four different continents. Among them are the iconic and well-known brown and polar bears, both widely distributed across the Northern hemisphere. Their intraspecific genetic structuring has been extensively investigated, albeit with a focus on genetic markers from maternally inherited parts of their genomes (mitochondrial DNA). The evolutionary relationship and divergence time between brown and polar bears have recently triggered an extensive debate, while less focus has been put on to other parts of the ursid phylogeny, particularly to a clade of three Asian bear species. To date, whole genomes of more than 100 bear individuals from four different species have been sequenced. Yet, one fundamental part of the genome has been largely omitted from specific analyses, in bears as well as in most other mammals: the Y chromosome. The mammalian Y chromosome provides a unique perspective on the evolutionary history of organisms due to its distinct features, and specifically reflects the patriline because of its male-specific inheritance. The characteristics of this chromosome make it well suited to complement and contrast evolutionary inferences based on other genetic markers, and to uncover processes like sex-biased gene flow and hybridization. The unique insights that can be gained from analyses of Y-linked genetic variation made me utilize this part of the genome to investigate the evolution of male lineages in bears. Studying the patriline is particularly promising in this taxonomic group because of male-biased dispersal and a complex and fast radiation of bears. The analysis of Y-chromosomal genetic markers is thus the common theme of this dissertation: I present the identification of large amounts of Y-chromosomal sequence, the development of male-specific markers from such sequences, and the application of these markers to trace the evolution of male lineages of different bear species. Specifically, I developed a molecular sex determination system based on the detection of two Y-linked fragments that allows to reliably discriminate between females and males from seven different bear species (Bidon et al. 2013). The approach is highly sensitive, bear-specific, and can be applied in standard molecular laboratories. This makes it valuable in conservation genetics and forensic applications, e.g. to analyze non-invasively collected samples. Furthermore, I used Y-linked markers in a comprehensive and range-wide sample of brown and polar bears, and show that male-biased gene flow plays an important role in distributing genetic material throughout the ranges of both species (Bidon et al. 2014). In brown bears, I detected a lack of paternal population structuring which is in strong contrast to the detailed structuring of the matriline. Analyzing Y-chromosomal sequences from all eight bear species, I present a phylogeny of the patriline that largely resembles the topology from other nuclear markers but is different from the topology of the mitochondrial gene tree (Kutschera et al. 2014). This discordance among loci generates interesting hypotheses about inter-species gene flow, particularly among American and Asiatic black bears. With the identification of almost two million basepairs of Y-chromosomal sequence and the analysis of an unprecedented large male-specific dataset in polar bears, a high-resolution view on the distribution of their intraspecific variation was obtained (Bidon et al. 2015). In particular, two clades that are divergent but do not show pronounced phylogeographic structure were detected, confirming the great dispersal capacity of males of this high arctic species. This dissertation thus represents a comprehensive investigation of Y-linked genetic variation on the intra- and interspecific level in a non-model organism. With my research, I contribute to an increased understanding of the complex evolutionary history of bears. In particular, I show that male-biased gene flow strongly influences the distribution of nuclear genetic variation, and that the contrast between phylogenies of differentially inherited markers can help to understand interspecific hybridization between closely related species. Moreover, my findings demonstrate the potential of Y-chromosomal markers to uncover unknown evolutionary patterns and processes. This applies not only to bears but to many species, even such that are generally well known and well described.
• HINTERGRUND: Das Y Chromosom ist ein wesentlicher Bestandteil des Säugetiergenoms, und kann als männchen-spezifischer genetischer Marker einzigartige und interessante Einblicke in die Evolutionsgeschichte von Organismen liefern. Es hat einige besondere Eigenschaften, die es von anderen Teilen des Genoms unterscheiden. Dazu gehören unter anderem die Vererbung von Vater zu Sohn (paternale Vererbung), sowie das weitgehende Fehlen von interchromosomaler Rekombination (Jobling et al. 2014). Evolutive Analysen beruhen meist auf der Analyse von mütterlicherseits (maternal) vererbter DNA der Mitochondrien oder auf Erbinformation der Autosomen des Zellgenoms. Letztere werden von beiden Geschlechtern an die Nachkommen weitergeben. Da unterschiedlich vererbte Teile des Genoms unterschiedliche Muster und Prozesse abbilden können, bleibt etwa der durch die Wanderung von Männchen vermittelte Genfluss durch die Analyse von mitochondrieller DNA unerkannt. Die kombinierte Analyse unterschiedlicher Marker ermöglicht es nun, potentielle Kontraste zwischen ihnen, z. B. die Abbildung unterschiedlicher Verwandtschaftsbeziehungen (Topologien der Stammbäume), darzustellen. Es sind diese Kontraste, die uns z. B. auf Hybridisierung zwischen Arten schließen lassen, und damit unser Verständnis für evolutive Muster und Prozesse erweitern können (Fahey et al. 2014). Das Y Chromosom ist bisher nur in sehr wenigen Arten, hauptsächlich in Modellorganismen wie Mensch und Maus, ausgiebig sequenziert und charakterisiert worden. Auch liegen nur für wenige Arten evolutive Analysen basierend auf diesem genetischen Lokus vor. Die Ursachen dafür sind in den spezifischen Eigenschaften des Y Chromosoms zu finden, z.B. in der großen Zahl sich wiederholender (repetitiver) Sequenzabschnitte, oder der geringen Dichte an Protein-kodierenden Genen. Deshalb wurde das Y Chromosom auch in vielen Studien, die genomweite Daten erheben, entweder gar nicht sequenziert (indem Weibchen untersucht wurden) oder zumindest nicht spezifisch analysiert (Greminger et al. 2010). Eine Gruppe innerhalb der Säugetiere, für die das Y Chromosom als genetischer Marker vielversprechend ist, ist die Familie der Bären (Ursidae). Es gibt heute acht Bärenarten, die auf vier verschiedenen Kontinenten vorkommen (McLellan & Reiner 1994). Unter ihnen sind die gut untersuchten und bekannten Braun- und Eisbären und der Große Panda. Die Evolutiongeschichte und der Zeitpunkt der Artaufspaltung von Braun- und Eisbären hat in den letzten Jahren eine intensive Debatte erlebt (z. B. Hailer et al. 2012, Liu et al. 2014). Es gibt aber auch Arten, deren Evolutionsgeschichte weniger gut untersucht ist, etwa drei nahverwandte Bärenarten Asiens. Die evolutive Entwicklung der Bären fand innerhalb einer relativ kurzen Zeit von wenigen Millionen Jahren statt, weshalb Hybridisierung und andere evolutive Prozesse die Entschlüsselung ihrer Verwandtschaftsverhältnisse entscheidend beeinflussen können. Die Analyse unterschiedlich vererbter genetischer Marker kann hier wertvolle Einblicke liefern. Geschlechtsspezifische Unterschiede im Ausbreitungsverhalten, wie sie für Braunbären gut dokumentiert sind (McLellan & Hovey 2001), lassen außerdem Unterschiede in der Populationsstruktur basierend auf maternal bzw. paternal vererbten Markern erwarten. Trotzdem wurden Marker auf dem Y Chromosom bisher kaum verwendet um phylogenetische bzw. phylogeographische Muster und Prozesse in Bären zu untersuchen. DURCHGEFÜHRTE STUDIEN: In der vorliegenden Dissertation präsentiere ich die Identifizierung von fast zwei Millionen Basenpaaren Y-chromosomaler DNA-Sequenz im Eisbären, die Verwendung solcher Sequenzen um Männchen-spezifische genetische Marker für verschiedene Bärenarten zu entwickeln, und die Anwendung dieser Marker, um die männlichen Erblinien von Bären zu untersuchen. Darüber hinaus zeige ich, dass das Y Chromosom ein wichtiges Werkzeug in der Forensik und Naturschutzgenetik ist. So beschreibe ich die Entwicklung eines zuverlässigen Tests für die molekulare Geschlechtsbestimmung bei sieben Bärenarten (Bidon et al. 2014). Der Test basiert auf der PCR-Amplifikation von zwei DNA-Fragmenten des Y Chromosoms, und einem DNA-Fragment des X Chromosoms und deren Nachweis mittels Gelelektrophorese. Dadurch können Weibchen und Männchen zuverlässig voneinander unterschieden werden. Durch die geringe Länge der zu amplifizierenden Fragmente und der hohen Sensitivität eignet sich die Methode auch für nicht-invasiv gesammeltes Probenmaterial, wie z. B. Kot und Haare, das sich oft durch geringe DNA Quantität und Qualität auszeichnet. Der Test kann in molekularbiologischen Standardlaboren leicht angewendet werden und ist daher vielfältig einsetzbar. Darüber hinaus ist er spezifisch für Bären, sodass bei Proben, die mit DNA einer anderen Art kontaminiert sind, das Ergebnis nicht verfälscht werden kann. Des Weiteren habe ich in meiner Arbeit die innerartliche Populationsstruktur der männlichen Erblinien von Braun- und Eisbären über deren gesamte Verbreitungsgebiete hinweg untersucht und mit dem bekannten Muster der weiblichen Erblinien der mitochondriellen DNA verglichen (Bidon et al. 2013). Hierzu wurden mit Hilfe des Eisbärgenoms Sequenz- und Mikrosatellitenmarker auf dem Y Chromosom entwickelt. Bevor die Marker in 130 Individuen angewendet wurden, wurde deren Y-chromosomaler Ursprung durch den Nachweis Männchenspezifischer Amplifikation überprüft. Das ausgeprägte Ausbreitungsverhalten männlicher Braunbären kann durch Y-spezifische Marker abgebildet werden. Es war deshalb zu erwarten, dass sich die paternale Populationsstruktur von dem Muster mütterlicherseits vererbter, mitochondrieller DNA, unterscheidet. Tatsächlich ist dieser Unterschied so stark ausgeprägt, dass identische Y Chromosomen in geographisch weit voneinander entfernten Gebieten vorkamen. Dies stellt einen deutlichen Kontrast zur maternalen Populationsstruktur von Braunbären dar, die durch geographisch klar getrennte und nicht überlappende Gruppen charakterisiert ist (Davison et al. 2011). Eine Sequenzvariante (Haplotyp) des Y Chromosoms war besonders häufig und kam über das gesamte Verbreitungsgebiet hinweg vor. Analysen basierend auf Y-chromosomalen Mikrosatellitendaten zeigten eine größere Variabilität, die jedoch keine geographische Struktur widerspiegelte. Auch in Eisbären war ein Y-chromosomaler Haplotyp besonders häufig und über große geographische Distanzen verbreitet. Der Unterschied zur mitochondriellen Struktur war jedoch weniger stark ausgeprägt, was das beträchtliche Ausbreitungspotential beider Geschlechter dieser Art veranschaulicht. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Männchen beider Bärenarten ihr genetisches Material über große räumliche Distanzen verbreiten, und dass dieser wichtige Prozess in der Betrachtung der Evolutionsgeschichte berücksichtigt werden muss. In meiner Dissertation habe ich neben der innerartlichen Variation auch die zwischenartliche Variation des Y Chromosoms untersucht. Nicht alle Verwandtschaftsbeziehungen der acht heute lebenden Bärenarten sind eindeutig geklärt (Pagès et al. 2008, Nakagome et al. 2008). Auf Grund von Diskrepanzen zwischen mitochondriellen und nukleären Stammbaumtopologien, verspricht die Analyse des Y Chromosoms hier aufschlussreiche Einblicke in potentielle Hybridisierung zwischen verschiedenen Bärenarten. Ich konnte zeigen, dass die Topologie des auf Y-chromosomalen Daten basierenden Stammbaums weitgehend der Topologie des auf mehreren autosomalen Genorten basierenden Artenbaums entspricht (Kutschera et al. 2014). Besonders interessant ist hierbei die Position des Amerikanischen Schwarzbären. Während dieser in der Y-chromosomalen Topologie ein Geschwistertaxon zu Braun- und Eisbären bildet, bildet er in der mitochondriellen Topologie ein Geschwistertaxon zu Asiatischen Schwarzbären (Yu et al. 2007, Krause et al. 2008). Genfluss und Introgression von mitochondrieller DNA von Asiatischen in Amerikanische Schwarzbären könnte diese Diskrepanz zwischen maternaler und paternaler Topologie erklären. Jedoch bleibt zu klären wo diese Hybridisierung stattgefunden haben könnte, da Fossilien, die eine geographische Überlappung dieser beider Arten belegen könnten, bisher fehlen (McLellan & Reiner 1994). Um die Analysen des Y Chromosoms auf eine größere Datengrundlage stellen zu können, ist es wichtig weitere Sequenzen dieses Chromosoms im Genom zu identifizieren. Zwar gibt es ein Referenzgenom eines männlichen Eisbären (Li et al. 2011), jedoch wurden die Sequenzfragmente (Scaffolds) bisher keinen bestimmten Chromosomen zugeordnet. Mit der Suche nach bekannten Ychromosomalen Genen aus anderen Säugetieren konnten Scaffolds mit Ychromsomalem Ursprung identifiziert werden (Bidon et al. 2013, 2014, 2015, Kutschera et al. 2014). Mit Hilfe eines Vergleiches der relativen Abdeckung (Coverage) von Sequenzdaten eines weiteren Männchens und eines Weibchens (Miller et al. 2012) im Referenzgenom mit erwarteten Coverage-Werten, konnte ein Großteil der Scaffolds einer bestimmten chromosomalen Kategorie (autosomal, Xchromosomal, Y-chromosomal) zugeordnet werden (Bidon et al. 2015). So gelang es, fast zwei Millionen Basenpaare DNA-Sequenz auf dem Y Chromosom zu identifizieren. Damit konnten die intraspezifische Populationsstruktur des Eisbären mit sehr hoher Auflösung untersucht, und jedem Individuum spezifische Substitutionen zugeordnet werden. Es zeigten sich außerdem zwei divergente Ychromosomale Gruppen, die jeweils Individuen aus unterschiedlichen Regionen (Alaska und Spitzbergen) umfassen und damit keine deutliche geographische Struktur abbilden. FAZIT: Die Verwendung des Y Chromosoms für die Untersuchung evolutiver Fragestellungen kann Signale liefern, die sich stark vom bekannten Muster anderer Marker unterscheiden. Diese Kontraste zwischen unterschiedlich vererbten Genorten liefern uns wertvolle Einblicke in die Evolutionsgeschichte von Organismen. Diskrepanzen in der Populationsstruktur etwa können auf geschlechtsspezifischen innerartlichen Genfluss hindeuten. Mütterlicherseits vererbte mitochondrielle Marker, wie sie in der Phylogeographie traditionell häufig verwendet wurden (Garrick et al. 2015), können die Populationsstruktur einer Art überschätzen, wenn, wie bei vielen Säugetieren der Fall, sich Männchen weiter ausbreiten als Weibchen (Greenwood 1980). Die Unterschiede zwischen Topologien von Genbäumen, die auf verschiedenen Markern basieren, erlauben uns außerdem Rückschlüsse über Hybridisierung zwischen Arten zu ziehen. Auf Bären bezogen bedeuten die Ergebnisse meiner Dissertation, dass männlicher Genfluss die räumliche Verbreitung von genetischem Material stark beeinflusst. Es konnte sowohl für Braun- als auch für Eisbären gezeigt werden, dass Y Chromosomen über große geographische Distanzen verbreitet wurden. Des Weiteren zeigen der Vergleich der Stammbaumtopologien unterschiedlich vererbter Genorte und die dabei deutlich werdenden Diskrepanzen, dass Hybridisierung zwischen Bärenarten einen bedeutsamen Prozess in deren Evolutionsgeschichte darstellt. Damit ist diese Arbeit eine umfassende Untersuchung der Variation des Y Chromosoms in einem Nicht-Modell-Organismus auf inner- und zwischenartlicher Ebene. Auch machen meine Studien deutlich, dass das Y Chromosom als genetischer Marker einen besonderen Blickwinkel auf evolutive Muster und Prozesse ermöglicht und für die molekulare Geschlechtsbestimmung unerlässlich ist. Die Untersuchung dieses Teil des Genoms trägt damit entscheidend dazu bei, unser Verständnis der Evolution zu erweitern. Die Generierung immer längerer Ychromosomaler Sequenzen wird evolutive Analysen der männlichen Erblinie mit immer höherer Auflösung ermöglichen, in Bären und in anderen Säugetieren.