Open Access

Jan Gajewski

• If the biotechnological production of chemicals can further replace or support regular synthetic chemistry, industry will be able to move away from fossil oils towards renewable sources. However, in many cases the much needed adaptation of biotechnological production systems is not yet developed to the necessary level. For processes where short fatty acids (FA) are needed, as for example in the microbial production of biofuels in the gasoline range, protein engineering had not yet delivered feasible solutions. In this thesis, several approaches to introduce chain length control on type I fatty acid synthases (FAS) were established and made available in a publication and two patents. Therein, engineering was focused on rational design based on available structural information. First, the type I FAS from C. ammoniagenes was used as a model enzyme to probe modifications on FAS in a low complex in vitro environment in order to gain information about structure-function relationships. At this stage, engineering was conducted in several rounds, first addressing possible ways to alter product distributions by changing substrate affinities through concise mutations in binding channels. Several FAS constructs were generated ranging from first successes, where short FA were produced as side products, to FAS where native chain length programming was overwritten and only short FA were produced. Furthermore, another engineering target was addressed with the modification of domain-domain interactions on FAS. For its exploitation to direct synthesis, contact surfaces on catalytic domains were changed to interfere with acyl carrier protein binding. This channeling of the kinetic process on the enzyme led to similar successes and short FA became the primary product. The two approaches have proven to be potent tools to introduce systems of chain length control in FAS. This rational engineering has the big advantage that it is mostly minimally invasive and due to the high conservation of de novo FA synthesis, individual mutations could easily be used in other FAS (and their organisms) as well. Even heterologous expression of modified FAS genes is feasible. Engineering was not only tested in a defined in vitro environment and but also in S. cerevisiae as an exemplary in vivo system. The results eventually confirmed the in vitro findings and proved that the chosen engineering could be transferred to more complex systems. Even before any optimization for highest output, the titers of short FA from S. cerevisiae fermentation matched previous reports with 118 mg/L. In sum, this work covers several layers from basic research to preliminary applications. The presented modifications to create short FA producing FAS can be a key step in synthesis pathways and will likely enable a whole range of new succeeding research. It can be seen as a valuable contribution towards establishing novel ways for the production of chemicals from renewable sources.
• In der Natur kommen Fettsäuren (FA) in allen eukaryotischen und bakteriellen Organismen vor. Die für die Herstellung verantwortlichen Enzyme werden als Fettsäuresynthasen (FAS) bezeichnet. In den letzten Jahren erhielt die Erforschung von FAS erhöhte Aufmerksamkeit, da ihr Potential für biotechnologische Anwendungen erkannt wurde: Die durch FAS hergestellten FA können eine Schlüsselrolle in der Herstellung von Lebensmittelzusätzen, Emulgatoren und auch Biokraftstoffen spielen. Der biotechnologische Einsatz von FAS ist zurzeit aber durch ihr natürliches Produktspektrum eingeschränkt, das typischerweise im Bereich der langen FA liegt. Für Anwendungen, in denen z.B. kurzkettigere Produkte benötigt werden, wurden in dieser Arbeit FAS durch rationales Engineering verändert. Dazu wurden Typ I FAS verwendet, bei denen alle enzymatischen Zentren auf einen Multienzymkomplex liegen. Diese sind in ihrer Syntheseleistung den Typ II FAS überlegen. In einer ersten in vitro Studie wurden für eine Herstellung von kurzen FA in Corynebakterium ammoniagenes FAS Substrat-Affinitäten in den kettenlängenbestimmenden enzymatischen Zentren durch gezielte Mutationen modifiziert. Die Ketoacylsynthase (KS, verantwortlich für die eigentliche Kettenverlängerung), die Acetyltransferase (AT) und die Malonyl/Palmotyl-Transferase (MPT, beide verantwortlich für die Bereitstellung der Substrate) wurden an insgesamt fünf Positionen mutiert. Als Grundlage dienten dazu die ausgiebigen Strukturdaten der homologen Saccharomyces cerevisiae FAS. Außerdem wurde die Arbeit durch Molekular-Dynamik-Simulationen von Bindungsereignissen und die Entwicklung eines quantitativen Computer-Modells zur Simulation des Reaktions-Netzwerks von FAS durch die Forschungsgruppe von Prof. Grubmüller (MPI für Biophysikalische Chemie, Göttingen) unterstützt. Schließlich konnten so die Anteile der kurzkettigen Produkte der FAS, wie z.B. Octanoyl-CoA, in den in vitro Assays auf zunächst 47% und später sogar auf 74% gesteigert werden. In weiteren Studien wurde auch die Interaktion von Domänen zur gezielten Veränderung von Synthesewegen auf FAS genutzt. Durch die gezielte Veränderung der Oberfläche von ACP (eine Proteindomäne, an die Zwischenprodukte während der Synthese kovalent gebunden sind) und der KS Domäne wurden so die Reaktionsflüsse gesteuert. Ausgehend von einem bereits mutierten Konstrukt konnte auch hier eine Steigerung der spezifischen Synthese von kurzen Acyl-CoA-Estern erreicht werden: von zunächst 18% in der Referenz-Variante wurde der Produktanteil von Octanoyl-CoA auf bis zu 77% gesteigert. Diese Studie zur gerichteten Synthese durch Engineering von Domänen-Domänen-Interaktionen ist die erste erfolgreiche Machbarkeitsstudie ihrer Art. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die guten in vitro Ergebnisse zur Kettenlängenkontrolle auch in einem wesentlich komplexeren in vivo Umfeld zu ähnlichen Resultaten führen würden. In einer Kooperation mit der Forschungsgruppe von Prof. Boles des Fachbereichs der Biowissenschaften der Goethe Universität Frankfurt wurden Saccharomyces cerevisiae Stämme zur Produktion von kurzen FA entwickelt. Die äquivalenten Mutationen in KS, MPT und AT Domänen aus den ersten in vitro Ansätzen wurden dafür in die Hefen eingeführt. Ohne weitere Optimierungen lagen die höchsten Konzentrationen an kurzen FA bei 118 mg/L YPD Medium. Neben der Modifikation der Kettenlängenkontrolle, wurde auch die enge Verwandtschaft von FAS zu den Polyketidsynthasen genutzt. FAS eignen sich als Modellproteine für die Erforschung von PKS Systemen, die oftmals schwer zugänglich sind. In einer Pilotstudie wurde ein gekoppelter Syntheseweg aus zwei in Reihe agierenden modifizierten FAS zur Herstellung eines einfachen Polyketids entwickelt. Als erste FAS wurden dabei einige der oben beschriebenen C. ammoniagenes FAS Konstrukte verwendet, welche Octanoyl-CoA herstellen. Eine zweite FAS wurde so modifiziert, dass sie Octanoyl-CoA aufnehmen kann und dieses zweifach zum Endprodukt 6-Heptyl-4-hydroxypran-2-on verlängert. In einer Eintopf in vitro Synthese konnten nach mehrmaliger Optimierung von verschiedenen Parametern, wie den Substratausgangskonzentrationen, Ausbeuten von bis zu 35% (bezogen auf das jeweils limitierende Substrat) erzielt werden. Diese Promotion zeigt somit wichtige Ansätze für die gezielte Erweiterung des FAS-Produktspektrums auf, die unter anderem als biotechnologische Lösungen für Prozesse dienen können, in denen die Produktion von kurzen Acyl-CoA-Estern wichtiger Bestandteil ist.