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Beate Hoffmann

• We often only realize how important health is when diseases manifest themselves through their symptoms and, ultimately, in a diagnosis. Over time, we suffer from many diseases starting with the first childhood disease to colds to gastrointestinal infections. Most diseases pass harmlessly and symptoms fade away. However, not all diseases are so harmless. Alzheimer’s disease, breast cancer, Parkinson’s disease, and colorectal cancer usually cause severe illness with high mortality rates. In pharmaceutical research, efforts are therefore being made to determine the molecular basis of them in order to provide patients with potential relief and, at best, healing. A special group of regulators, involved in the previously mentioned diseases, are voltage-gated proton channels. Thus, the understanding of their structure, function, and potential drug interaction is of great importance for humanity. Voltage-gated proton channels are localized in the cell membrane. As their name indicates, they are controlled by voltage changes. Depolarization of the cell membrane induces conformational changes that open these channels allowing protons to pass through. Here, the transfer is based on a passive process driven by a concentration gradient between two individual compartments separated by the cell membrane. Voltage-gated proton channels are highly selective for protons and show a temperature- and pH-dependent gating behavior. However, little is known about their channeling mechanism. Previous experimental results are insufficient for understanding the key features of proton channeling. In this thesis, for the first time, the cell-free production of voltage-sensing domains (VSD) of human voltage-gated proton channels (hHV1) and zebrafish voltage-sensing phosphatases (DrVSP) is described. Utilizing the cell free approach, parameters concerning protein stability, folding and labeling can be easily addressed. Furthermore, the provision of a membrane mimetic in form of detergent micelles, nanodiscs, or liposomes for co-translational incorporations of these membrane proteins is simple and efficient. Both VSDs were successfully produced up to 3 mg/ml. Furthermore, the cell-free synthesis enabled for the first time studies of lipid-dependent co-translational VSD insertions into nanodiscs and liposomes. Cell-free produced VSDs were shown to be active, and to exist mainly as dimers. In addition, also their activation was stated to be lipid-dependent, which has not been described so far. Solution-state NMR experiments were performed with fully and selectively labeled cell-free produced VSDs. With respect to the development of potential drug candidates, I could demonstrate the inhibition of the VSDs by 2-guanidinobenzimidazole (2GBI). Determined KD values were comparable to literature data for the human construct. For the first time, a low affinity for 2GBI of the zebrafish VSD could be described. In future, the combination of a fast, easy and cheap cell-free production of fully or selectively labeled VSDs and their analysis by solution state NMR will enable structure determinations as well as inhibitor binding studies and protein dynamic investigations of those proteins. The results of these investigations will serve as a basis for example for the development of new drugs. In addition, a detailed description of the lipid-dependent activity might be helpful in controlling the function of voltage-gated proton channels in cancer cells and thereby reducing their growth or disturbing their cell homeostasis in general.
• Oft merken wir erst, wie wichtig Gesundheit ist, wenn sich Krankheiten durch ihre Symptome und letztlich durch eine Diagnose manifestieren. Mit der Zeit leiden wir an vielen Krankheiten, beginnend mit der ersten Kinderkrankheit über Erkältungen bis hin zu Magen-Darm-Infektionen. Die meisten Krankheiten verlaufen harmlos und die Symptome verschwinden. Jedoch sind nicht alle Krankheiten so harmlos. Alzheimer, Brustkrebs, Parkinson und Kolorektalkarzinome verursachen normalerweise schwere Krankheitsverläufe mit hohen Sterblichkeitsraten. In der pharmazeutischen Forschung ist man daher bestrebt, die molekularen Grundlagen dieser Krankheitsbilder zu ergründen, um Patienten eine potentielle Erleichterung und bestenfalls Heilung zu bieten. Eine spezielle Gruppe von Regulatoren, die an den zuvor erwähnten Krankheiten auf molekularer Ebene beteiligt sind, sind spannungsgesteuerte Protonenkanäle. Dementsprechend ist das Verständnis deren Struktur, Funktion und potenziellen Interaktionen mit Arzneimitteln für die Menschheit von großer Bedeutung. Spannungsgesteuerte Protonenkanäle sind in der Zellmembran lokalisiert. Wie ihr Name vermuten lässt, werden sie durch Spannungsänderungen gesteuert. Die Depolarisierung der Zellmembran induziert Konformationsänderungen, die diese Kanäle öffnen und Protonen passieren lassen. Die Übertragung basiert hier auf einem passiven Prozess, der durch einen Konzentrationsgradienten zwischen zwei, durch die Zellmembran getrennten, einzelnen Kompartimenten gesteuert wird. Spannungsgesteuerte Protonenkanäle sind hochselektiv für Protonen und zeigen ein temperatur- und pH-abhängiges Kanalisierungsverhalten. Über dessen Mechanismus ist jedoch wenig bekannt. Frühere experimentelle Ergebnisse sind bisweilen nicht ausreichend, um ein Gesamtbild des Protonenkanalisierungsprozesses zu erschließen. Die vorliegende Dissertation beschreibt erstmalig die zellfreie Produktion spannungserfassender Domänen (voltage-sensing domains, VSD) von spannungsgesteuerten Protonenkanälen (hHV1) und spannungserfassenden Phosphatasen aus Zebrafisch (DrVSP). Unter Verwendung der zellfreien Proteinproduktion können Parameter wie Proteinstabilität, -faltung und -markierung leicht adressiert werden. Darüber hinaus ist hierbei die Bereitstellung eines Membranmimetikums in Form von Detergenz-Mizellen, Nanodiscs oder Liposomen für die co-translationale Insertion von Membranproteinen einfach und effizient möglich. Beide VSDs konnten erfolgreich zu ~3 mg/ml produziert werden. Darüber hinaus ermöglichte die zellfreie Synthese erstmalige Analysen einer lipidabhängigen co-translationalen VSD-Insertion in Nanodisks und Liposomen. Zellfrei produzierte VSDs erwiesen sich als aktiv und bildeten nachweisbare Dimere. Zusätzlich wurde herausgefunden, dass ihre Aktivierung lipidabhängig ist, was bisher so nicht beschrieben wurde. Die Lösungs-NMR-Experimente erfolgten mit vollständig- und selektivmarkierten, zellfrei hergestellten VSDs. Im Hinblick auf die Entwicklung potenzieller Wirkstoffkandidaten konnte ich die Hemmung der VSDs durch 2-Guanidinobenzimidazol (2GBI) nachweisen. Die ermittelten KD-Werte waren vergleichbar mit Literaturdaten für das menschliche Konstrukt. Zum ersten Mal konnte eine geringe Affinität für 2GBI zur VSD aus Zebrafisch beschrieben werden. In Zukunft wird die Kombination einer schnellen, einfachen und billigen zellfreien Proteinproduktion von vollständig- oder selektivmarkierten VSDs und deren Analyse durch die Lösungs-NMR sowohl Strukturbestimmungen als auch Inhibitor-Bindungsstudien und Proteindynamikuntersuchungen ermöglichen. Darüber hinaus könnte eine detaillierte Beschreibung der lipidabhängigen Aktivität hilfreich sein, um die Funktion von spannungsgesteuerten Protonenkanälen in Krebszellen zu kontrollieren und dadurch das Wachstum dieser Zellen zu reduzieren oder im Allgemeinen ihre Zellhomöostase zu stören.