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Victor Didier Pérez Meza

• Structured illumination microscopy (SIM) is part of the super-resolution methods developed at the beginning of this century. To produce a super-resolution image SIM requires three things: 1) illumination of the sample with a periodic pattern, 2) acquisition of multiple images per plane under different pattern’s phases and orientations and 3) the processing of these images has to be carried with a reconstruction algorithm. The result of the reconstruction is an image with a resolution gain that is proportional to the frequency of the pattern (po). The typical SIM set-up uses an epi-fluorescence configuration, thus the interference angle of the beams that create the pattern is restricted by the angular aperture of the objective. Under this restriction the maximum value of po is given by the cut-off frequency of the objective lens and sets at 2 the maximum resolution gain of SIM under linear illumination. In the first part of this thesis we present the implementation and characterization of the 2D-SIM set-up designed by Dr. Bo-Jui Chang (B-J. Chang et al., PNAS 2017), this design exploits the concept introduced by light-sheet microscopy, i.e. separation of illumination and detection paths to obtain resolution gains larger than the usual two-fold (Chapter 3). The set-up is named coherent structured illumination light-sheet based fluorescence microscopy (csiLSFM) and it consists of a triangular array of three objectives, such that two are used for illumination and one for detection. With the independent illumination arms is possible to interfere two coherent light-sheets at angles beyond the angular aperture of the detection lens, attaining the maximum interference angle of 180° when the light-sheets counter-propagate. This condition delivers a pattern with a po 1.4 times larger than the cut-off frequency (ωo), hence our set-up provides generic resolution gains of 2.4. The extraction of the high spatial frequencies that produce the resolution gain in the csiLSFM is a challenge due to a low pattern modulation. The low modulation inherently arises because the frequency associated to the pattern period lies beyond the cut-off frequency of the detection lens. To overcome this challenge we developed a filtering strategy that facilitates the withdrawal of information from a SIM data set, simultaneously the proposed filtering process optimizes the reconstruction algorithm by reducing the periodic artifacts that are recurrent in SIM images. In this same chapter we also performed an spectral analysis of the artifacts and determined that they originate from irregularities in the power spectrum that occur due to the partial or total lack of certain spatial frequencies (fig.4.2 and 4.3), our reconstruction reduces this information drops and diminishes the artifact occurrence. The relevance of our reconstruction pipeline is that it delivers a standardized process to enhance the SIM image in a current context in which the commonly used reconstruction algorithms employ empirical tuning to improve it (fig.4.13). Moreover, the pipeline is applicable to the csiLSFM data and also to images acquired with any other 2D-/3D-SIM set-up (fig.4.10 and 4.11). The processing of various image data sets acquired with the csiLSFM exposed us to the question of how low the modulation of the illumination pattern can be before no super-resolution frequencies can be extracted. Answering this question is important to guarantee that the SIM data contains enough spatial frequencies to provide significant resolution gains. Thus in chapter 5 we developed a quantitative metric to indirectly determine the pattern modulation from the SIM data and find its critical value to use it as evaluation criterion. We called this metric the quality factor (Q-factor) and it represents the normalized strength (amplitude) of the extracted frequencies respect to the Gaussian noise contained in the images. Through simulations we estimated that Q=0.11 is a critical value and a SIM data set requires this as minimum value is to deliver a significant resolution gain. Q works then as an assessment tool for classifying SIM data as optimal or sub-optimal, i.e. Q≥0.11 or Q<0.11. We demonstrated such application with data acquired in various SIM commercial set-ups to prove its feasibility in the field (fig.5.6-5.11) As mentioned at the beginning of this abstract SIM requires a specialized set-up and a processing algorithm to produce super-resolution images. This thesis contributes to these two areas in the following aspects: first, in its linear version a structured illumination microscope is highly associated to a 2-fold resolution gain. Here we demonstrated the possibility of extending this gain to 2.4 using our custom set-up the csiLSFM. Second, a reconstructed SIM image is prone to artifacts due to the mathematical process it undergoes, here we analyzed the artifact sources and identified them with drops of spatial information in the reconstructed spectrum, based on these conclusions we designed a processing pipeline to facilitate the extraction of spatial frequencies and directly reduce artifacts. A third and final outcome of this thesis is the development and practical implementation of a quantitative index to evaluate the quality of SIM data in terms of its relevant information content (Q-factor). Accordingly, the overall contributions of this work were done in the areas of SIM set-up, SIM reconstruction procedure and SIM data evaluation.
• Structured illumination microscopy (SIM) gehört zu den Höchauflösungs Fluoreszenzmikroskopie Methoden, welche Anfang dieses Jahrhunderts entwickelt wurden. Um ein hochaufgelöstes Bild mittels SIM zu erzeugen, sind folgende Punkte zu beachten: 1) die Beleuchtung der Probe erfolgt über ein periodisches Muster, 2) Pro Ebene werden jeweils mehrere Bilder entsprechend unterschiedlicher Phasen und Richtungen des Musters aufgenommen, 3) die Verarbeitung dieser Bilder erfolgt mit einem Rekonstruktionsalgorithmus. Das Resultat der Rekonstruktion ist ein Bild mit einem Auflösungsgewinn die proportional zur Frequenz des Musters (po) ist. SIM Geräte verwenden typischerweise eine Epifluoreszenzkonfiguration, so dass entsprechende Beleuchtungs und Detektionspfade gekoppelt sind. Zudem werden Interferenzwinkel der Lichtstrahlen, die das Muster erzeugen, durch die Winkelöffnung des Objektivs begrenzt. Unter dieser Begrenzung liegt der Maximalwert von po in der Nähe der Grenzfrequenz des Objektivs. Aus diesem Grund liegt die Einstellung des maximalen Auflösungsgewinns von SIM auf 2 bei linearer Beleuchtung. Im ersten Teil dieser Arbeit präsentieren wir die Umsetzung und Charakterisierung der 2D SIM Konfiguration von Dr. Bo Jui Chang (B J. Chang et al., PNAS 2017). Dieses Design basiert auf dem Konzept der Lichtscheibenmikroskopie, d.h. der Trennung von Beleuchtungs und Detektionspfaden, um einen Auflösungsgewinn größer als den üblichen, zweifachen Wert zu erhalten. Diese Konfiguration bezeichnen wir als coherent structured illumination lightsheet based fluorescence microscopy (csiLSFM). csiLSFM besteht aus einer dreieckigen Anordnung von drei ähnlichen Objektiven, von denen zwei für die Beleuchtung und eines für die Detektion verwendet werden. Um einen Auflösungsgewinn größer als 2 zu erzielen mischen sich jeweils zwei kohärenten Lichtscheiben ein, in Interferenzwinkeln jenseits der Winkelöffnung des Detektionsobjektivs. Der maximale Interferenzwinkel von 180° ist erreicht, wenn sich die Lichtscheiben gegenläufig ausbreiten. Diese Voraussetzung liefert ein Muster mit entsprechender Frequenz po, die 1,4 mal größer ist als die Grenzfrequenz (ωo). Deshalb bietet der csiLSFM einen generischen Auflösungsgewinn von 2,4 (Gl.35). Kapitel 3 stellt den optischen Pfad des csiLSFM, die Aufbaukomponenten, die Ausrichtung und die theoretischen Berechnungen der zu erwarteten Auflösung und den maximalen Auflösungsgewinn vor. Das System kann auch folgendermaßencharakterisiert werden: Zunächst wurden Kalibrierkurven extrahiert, um die Bewegungsparameter der motorisierten Komponenten im Aufbau mit den Phasen und Perioden des Beleuchtungsmusters in Beziehung zu setzen (Abb.3.4 und 3.5). Zweitens wurde die experimentelle dreidimensionale Punktspreizfunktion (PSF) des Mikroskops sowohl für Weitfeld- als auch für SIM-Bilder erfasst. Die berechnete theoretische Auflösung wurde durch Vergleich mit den Abmessungen des PSFs validiert. Die beste laterale Auflösung des csiLSFM betrug 91 nm und wurde mit einem Objektiv mit einer Weitfeldauflösung von 301 nm erzielt (Tabelle 3.2). Die Möglichkeit, einen Auflösungsgewinn größer als zwei in biologischen Proben zu erhalten, wurde zudem an einigen biologischen Proben demonstriert (Abb.3.7 und 3.8). Aufgrund der geringen Mustermodulation ist die Extraktion der hohen Ortsfrequenzen, welche den Auflösungsgewinn im csiLSFM erzeugen, herausfordernd. Eine geringe Modulation entsteht dadurch, dass die der Musterperiode zugeordnete Frequenz außerhalb der Grenzfrequenz der Detektionslinse liegt. Um diese Herausforderung zu bewältigen, haben wir eine Filterstrategie entwickelt, welche die Entnahme von Informationen aus einem SIM-Datensatz erleichtert. Gleichzeitig optimiert der vorgeschlagene Filterprozess den Rekonstruktionsalgorithmus durch Reduzierung periodischer Artefakte, die in SIM--Bildern wiederkehrend sind. In Kapitel 4 beschreiben wir den Arbeitsablauf der vorgeschlagenen Rekonstruktionspipeline und demonstrieren deren Umsetzung in Datensätzen, die mit dem csiLSFM und anderen kommerziellen Mikroskopen erfasst wurden (Abb.4.4-4.12). Kern unserer Rekonstruktionsmethode ist die Entfaltung der Rohbilder mittelss Richardson-Lucy-Algorithmus vor jedem Rekonstruktionsversuch. Diese Strategie liefert höhere-räumliche Informationen mit größeren Amplituden, so dass sie in Bezug auf das Hintergrundrauschen relevanter werden. Im gleichen Kapitel haben wir auch eine Spektralanalyse der periodischen SIM-Artefakte durchgeführt und festgestellt, dass sie von Unregelmäßigkeiten im Leistungsspektrum stammen, die aufgrund des teilweisen oder vollständigen Fehlens bestimmter räumlicher Frequenzen auftreten (Abb.4.2 und 4.3). Unsere Strategie der Dekonvolution vor der Rekonstruktion reduziert den Informationsrückgang und glättet das Spektrumsprofil, um das Auftreten von Artefakten zu verringern und zudem ein standardisiertes Rekonstruktionsverfahren zu liefern. Die Relevanz unseres Rekonstruktionsverfahrens liegt darin, dass es eine standardisierte Prozessierung zur Bildverbesserung bietet. Dies wird ermöglicht in dem die gängigen Rekonstruktionsalgorithmen eine empirische Abstimmung zur Verbesserung des Bildes verwenden (Abb.4.13). Unsere Methode erfordert keine Abstimmung an das letztlich hochaufgelöste Bild und kann direkt auf 2D- und 3D-SIM Datensätze angewendet werden, wir konnten zeigen, dass unsere Rekonstruktion eine ähnliche bis bessere Bildqualität erreicht hat, als vergleichbar Methoden, die in kommerziellen Mikroskope implementiert sind (Abb.4.10 und 4.11). ...