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Michael Konetschnik

• Schätzungen der WHO zufolge waren 2015 weltweit rund 71 Millionen Menschen von einer chronischen Hepatitis C-Infektion betroffen. Die chronische Hepatitis C ist mit einem erhöhten Risiko für die Entstehung einer Leberzirrhose und eines hepatozellulären Karzinoms assoziiert. Die NS3/4A-Protease als zentraler Bestandteil der Replikationsmaschinerie des Virus spaltet das HCV-Polyprotein und ist in die Inaktivierung antiviraler Proteine involviert. Durch ihren maßgeblichen Einfluss auf die virale Fitness stellt sie einen entscheidenden Faktor für die chronische Persistenz des Virus im Wirtsorganismus dar. Die Protease ist auch eine wichtige Zielstruktur für spezifische antivirale Medikamente in der Behandlung der chronischen Hepatitis C. Der natürlich vorkommende Polymorphismus Q80K in der NS3/4A-Protease ist bei bis zu 47 % der Patienten schon vor Therapiebeginn feststellbar, insbesondere beim Genotyp 1a. Q80K führt zum Therapieversagen bei makrozyklischen Proteaseinhibitoren, insbesondere Simeprevir. Phylogenetische Analysen konnten zeigen, dass 96 % aller HCV-Gensequenzen mit Q80K von einem gemeinsamen, genetischen Vorfahren abstammen und sich die Mutation seit Mitte des 20. Jahrhunderts scheinbar stabil ausgehend vom nordamerikanischen Kontinent etabliert hat. Daneben wurden mit A91S/T und S174N sogenannte second site-Austausche identifiziert, die assoziiert mit Q80K vorkommen. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, welchen Einfluss diese second site-Austausche auf die Enzymaktivität und Proteinfaltung der Protease haben und ob sie mögliche Veränderungen durch den Q80K-Polymorphismus kompensieren. Nach Expression und Aufreinigung der NS3/4A-Protease wurden die Effekte von Q80K, A91S/T und S174N auf die Enzymaktivität und Thermostabilität mittels fluoreszenzbasierter Verfahren untersucht und im Zusammenhang mit einer in silico-3D-Strukturanalyse der Protease interpretiert. Es zeigte sich, dass A91S/T und S174N jeweils zu einer Angleichung der Thermostabilität des Proteins an den Wildtyp führen und somit Defizite in der Faltung der Protease durch Q80K kompensiert werden. Aufgrund der experimentellen Daten und der Topografie dieser Austausche innerhalb der NS3-Protease-Helikase-Struktur ist von indirekten Effekten der second site-Austausche auf die replikative Fitness der Virusvarianten auszugehen. Die hier charakterisierten Austausche in der NS3/4A-Protease tragen durch eine Stabilisierung der Proteinfaltung kritisch zur Stabilität des Q80K-Polymorphismus im Proteasegen des HCV Genotyp 1a bei.
• Chronic infection with the hepatitis C virus affects about 71 million people worldwide and is a major cause in the development of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Being involved in the processing of the viral polyprotein and the suppression of the innate immune response, the viral NS3/4A protease plays an important role in the replication cycle of the virus and contributes to the replicative fitness of the virus. As such the NS3/4A protease is a key target site for specific antiviral treatment against HCV infection. Q80K is a natural occurring polymorphism of the NS3/4A protease, leading to reduced susceptibility to the protease inhibitor Simeprevir. Depending on the geographical region, Q80K is prevalent in up to 47 % of infected patients mostly in genotype 1a. Phylogenetic investigations showed that 96 % of all HCV infections with Q80K were descended from one single lineage. According to these investigations, Q80K must have occurred in the mid of the 20th century in the United States, suggesting high transmissibility. In addition, the second-site substitutions A91S/T and S174N have been identified as strongly associated with Q80K. The amino acid substitution Q80K in the NS3/4A protease of the hepatitis C virus is highly prevalent only in genotype 1a, however, the underlying molecular mechanisms are largely unknown. This study/work aimed to investigate the potential impact of the second-site amino acid substitutions A91S/T and S174N on the enzymatic activity and/or protein fold of the NS3/4A-Q80K protease in a genotype 1a genomic background. After expression and purification of the NS3/4A protease for the wild type protein and the selected variants, the effect of Q80K on the protease fold and enzymatic activity, as well as potential compensatory mechanisms due to A91S/T and S174N were characterized by thermal shift and a FRET-based protease activity assay. Subsequently, the experimental data were interpreted in conjunction with data from in silico structure modeling based on available experimental structure information from the Protein Databank RCSB PDB. The data show a compensatory effect of A91S/T and S174N on changes in the NS3/4A protein fold caused by Q80K. In contrast, no such effect was observed in enzyme kinetics, possibly due to the lack of the NS3 helicase domain in the expressed constructs. The 3D structure topology of the second-site amino acid substitutions in NS3 suggests an indirect effect of the substitutions A91S/T and S174N on the protease–helicase domain interface. Based on these data, the fitness compensatory mechanism for Q80K variants due to second-site mutations is likely mediated by modulatory mechanisms on the interplay between both NS3 domains, protease and helicase, that can impact e. g. RNA replication and/or infectious virus particle assembly.