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Giulietta Volante

• Die Krebsstammzellforschung gelangte in den letzten Jahren vermehrt in den Fokus der Tumorforschung. Im Tumor bilden Krebsstammzellen eine kleine Population an Zellen mit Stammzelleigenschaften, wodurch sie eine große Rolle bei der Entstehung von Rezidiven, Metastasen, sowie der Entwicklung von Chemotherapieresistenzen spielen. Um eine gezielte Bekämpfung von Krebsstammzellen zu ermöglichen, müssen diese im Tumor zunächst zuverlässig durch Krebsstammzellmarker detektiert werden können. Gerade bei soliden pädiatrischen Tumoren, wie dem Hepatoblastom, ergeben sich hierbei Schwierigkeiten dadurch, dass im sehr heterogenen Tumorgewebe viele Zellen aufgrund der embryonalen Natur des Tumors bereits Stammzellmarker exprimieren, ohne dass es sich bei diesen Zellen um Krebsstammzellen handelt. Das Hepatoblastom ist mit 2/3 der Lebertumore des Kindes die häufigste maligne Leberneoplasie im Kindesalter. Auch wenn es bereits Hinweise auf das Vorliegen von Krebsstammzellen im Hepatoblastom gibt, so konnten diese bisher nicht genauer durch fest definierte Krebsstammzellmarker identifiziert werden. Um dies zu erreichen, wurden in dieser Arbeit die beiden Hepatoblastomzelllinien HuH6 und HepG2 auf die Expression der bereits bekannten Krebsstammzellmarker CD90, CD34 und CXCR4 überprüft. Zusätzlich wurde auf eine Bindung des „oval cell“ Antikörpers, OV-6, untersucht. Mittels Durchflusszytometrie-Analysen konnte eine Zellpopulation gefunden werden, welche die Oberflächenmarker CD34 und CD90 koexprimiert und gleichzeitig den OV-6 Antikörper bindet. Im nächsten Schritt wurden die Zellen auf einige Krebsstammzelleigenschaften überprüft. Zur weiteren Untersuchung dieser Subpopulation erfolgte mittels MACS (magnetic activated cell sorting) eine Anreicherung der CD90 exprimierenden Zellen. Diese wurde mittels qPCR auf die Expression der Pluripotenzmarker Oct4 und Nanog, sowie der Zytidindeaminase AID untersucht. Es konnte eine signifikant erhöhte Expression von AID und Oct4 detektiert werden. Im Gegensatz hierzu zeigte sich die Expression von EpCAM, c-myc und Albumin, welche als Kontrollgene untersucht wurden, nicht signifikant erhöht. Um auf das Metastasierungspotential der CD90 angereicherten Zellen rückzuschließen, wurde ein Migrationsassay mit angereicherten und depletierten Zellen durchgeführt. Hier wiesen die CD90 angereicherten Zellen, im Vergleich zu den depletierten Zellen eine erhöhte Migration auf. Im Tumorsphäroid-Assay war die HepG2 Zelllinie in der Lage Tumor-61 -sphäroide auszubilden. Nach der Passagierung zeigten diese eine erhöhte Expression der Krebsstammzellmarker CD90 und CD34, sowie der Pluripotenzmarker Oct4 und Nanog. Zusammengefasst kann mit den Krebsstammzellmarkern CD90, CD34 und OV-6 eine Subpopulation im Hepatoblastom identifiziert werden, die nach unseren Analysen Krebsstammzelleigenschaften aufweisen. Mithilfe dieses Markersets können nun neue Therapieansätze auf ihre Effektivität, Krebsstammzellen gezielt zu eliminieren, getestet werden.
• In recent years, cancer stem cells have increasingly become a major focus in tumor research. Cancer stem cells form a small population within the tumor with stem cell properties and play a key role in tumor recurrence, metastasis and chemotherapy resistance. Therefore, it is of great interest to have a reliable set of cancer stem cell markers in order to identify cancer stem cells and design a targeted cancer therapy. Particularly, in solid pediatric tumors, such as the hepatoblastoma, additional difficulties arise due to the fact that cells in these heterogeneous tumors already express stem cells markers, without being cancer stem cells due to the embryotic nature of the tumor itself. Hepatoblastoma is the most common malignant liver neoplasm in childhood, accounting for 2/3 of liver tumors in children. Even though studies indicated the presence of cancer stem cells in hepatoblastoma, cancer stem cell markers for hepatoblastoma have yet to be defined. For that purpose, in this study the expression of the well-known cancer stem cell markers CD90 and CD34 was tested in the two hepatoblastoma cell lines HuH6 and HepG2. Additionally, binding of the oval cell antibody OV-6 was analysed. Using flow cytometry analysis, a subpopulation was detected that co-expressed the cell surface markers CD34 and CD90 and showed binding of OV-6 as well. In the next step, the cells were tested for cancer stem cell characteristics. Therefore, CD90 expressing cells were enriched by using the MACS technique (magnetic activated cell sorting) and the expression of pluripotency markers Oct4 and Nanog as well as of the cytidine deaminase AID was examined by qPCR. A significantly increased expression of AID and Oct4 was detected. In contrast, the expression of EpCAM, c-myc and albumin, as control genes, was not significantly increased. A migration assay was performed with the enriched and depleted cells to give a hint for a possible metastatic potential of the cell population. The CD90-enriched cells showed increased migration compared to the depleted cells. In tumor sphere assays, the HepG2 cell line was able to form tumor spheres. These showed increased expression of the cancer stem cell markers CD90 and CD34, as well as the pluripotency markers Oct4 and Nanog, after several passaging.