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Nabil al- Ghaili

• Gene therapy is a promising therapeutic strategy that emerged from the attractive idea of targeting therapy at the molecular level. For many patients who suffer from genetic and acquired diseases that cannot be effectively treated by conventional treatment approaches gene therapy remains a huge hope of cure in spite of the hurdles regarding efficacy and safety that need to be overcome. The development of efficient gene transfer vehicles, mainly retroviral vectors, led to the first successful gene therapy trial, to treat patients suffering from X-linked severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID) using gene modified stem cells (Hacein-Bey-Abina, Le Deist et al. 2002). Despite the success of this trial, it revealed the danger of retroviral insertional mutagenesis as a major adverse event of gene therapy using gene-modified stem cells (Hacein-Bey-Abina, von Kalle et al. 2003). In contrast to stem cells, T cells are relatively resistant to insertional mutagenesis and transformation even after transduction with potent oncogenes using retroviral vectors (Newrzela, Cornils et al. 2008). However, mature T cells can self-renew, proliferate and survive for long periods. These criteria are supposed to render T cells prone to transformation. Therefore, the questions of mature T cells transformability and the control mechanism limiting their transformation are still elusive.
• Konventionelle therapeutische Verfahren für viele genetische und erworbene Krankheiten weisen verschiedenste Limitationen auf, was die Notwendigkeit neuer therapeutischen Strategien deutlich macht. Die Gentherapie ist eine vielversprechende Alternative, die auf die Idee der gezielten Therapie auf molekularer Ebene zurückzuführen ist. Für viele Patienten, die an genetischen und erworbenen Krankheiten leiden, die auf konventionelle Weise nicht effektiv behandelt werden können, stellt die Gentherapie trotz der damit verbundenen Schwierigkeiten bezüglich der Effizienz und Sicherheit eine große Hoffnung dar. Ein nennenswertes Beispiel für die Limitationen konventioneller Therapien sind die primären Immundefizienen (PID), eine Gruppe genetischer Erkrankungen, die das Immunsystem beeinträchtigen wie beispielsweise ,,sever combined immunodeficy‗‗ (SCID). Allogene HSC-Transplantation ist die einzige kurative Behandllung, die für PID zur Verfügung steht. HSC-Transplantation von einem gematchten Spender führt zu einer hohen Zahl an Heilungen und Überleben. Dennoch steht diese Option lediglich für etwa 15% aller Patienten zur Verfügung. Zudem verursachen Komplikationen durch geringe Effizienz, Toxizität und „Graft versus host disease― eine signifikante Mortalität. In einem Versuch, diese Hürden zu überwinden, wurden in den letzten beiden Jahren zwei erfolgreiche Gentherapie-Studien zur Behandlung von X-SCID Patienten initiiert. Trotz des generellen Erfolgs dieser Studien machten sie die Gefahr der retroviralen Insertionsmutagenese als großen Nebeneffekt der Gentherapie mittels genetisch modifizierter Stammzellen deutlich. Zwei Zelltypen werden gegenwärtig in der Gentherapie verwendet: zugängliche Stammzellen und voll differenzierte, langlebige Zellen wie zum Beispiel T-Zellen. Im Gegensatz zu Stammzellen haben Studien mit T-Zellen ein exzellentes Sicherheitsprofil, das in einer Serie von Gentherapie-Studien mit polyclonalen reifen T-Zellen erhalten wurde, die eine Resistenz reifer T-Zellen gegenüber der Transformation durch retrovirale Insertionsmutagenese zeigen. Weiterhin wurden in einer Studie zur Transformationsfähigkeit von T-Zellen murine polyklonale T-Zellen mit potenten T-Zell Onkogenen transduziert und in Rag-1-/- Mäuse transplantiert. T-Zellen zeigten im Gegensatz zu Stammzellen, die in der gleichen Studie bösartige Erkrankungen des Blutes hervorriefen, eine relative Resistenz gegen Transformation. Dennoch bestizen reife T-Zellen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Proliferation und können für lange Zeiträume überleben. Diese Kriterien sollten T-Zellen anfällig für die Transformation machen. Daher werden weitere Untersuchungen zur Transformationsfähigkeit von T-Zellen und den Mechanismen, die diese limitieren, benötigt. Vollständig differenzierte reife T-Zellen sind polyklonal in Bezug auf die T-Zell Rezeptor Spezifität. Um das T-Zell Rezeptor-Repertoire zu bewahren und den Überwuchs oder das Verschwinden individueller Klone zu verhindern, unterliegen die Diversität und Größe einzelner T-Zell Klone einer strikten Kontrolle. Diese wird durch die Kompetition zwischen verschiedenen T-Zell Klonen um spMHC-Liganden erzwungen, wodurch die Diversität und Anzahl an T-Zell klonen erhalten wird. Die interklonale Konkurrenz um spMHC-Liganden könnte einen wichtigen Kontrollmechanismus darstellen, der das Wachstum von prä-leukämischen T-Zell Klonen verhindert. Ein Indikator für die mögliche Rolle der interklonalen Kompetition um spMHC-Nischen in der Kontrolle der T-Zell Transformation wird durch die Pathogenese reifer T-Zellen in Lymphomen suggeriert, die durch das humane T-lymphotrope Virus 1 (HTLV-1) verursacht werden. In mehreren Studien wurde berichtet, dass viele HTLV-1 Infektionen für viele Jahre latent bleiben, bis die viral infizierten T-Zellen, meistens in älteren Patienten, ein Lymphom verursachen und mitunter versterben die Patienten, bevor sich Tumore bilden. Es ist bekannt, dass die Polyklonatlität naiver T-Zellen in älteren Menschen abnimmt was zu einer verringerten interklonalen Kompetition zwischen den T-Zellen führt. Dadurch könnte den HTLV-1 infizierten (prä-leukämischen) T-Zellen der Zugang zu spMHC-Nischen erleichter werden, was letzlich zu ihrer Transformation und Tumorbildung führen könnte. In der vorgelegten Arbeit wurde die Rolle untersucht, die die interklonale Kompetition zwischen T-Zell um spKHC-Nischen spielt. Dafür wurde die T-Zell Polyklonalität durch die Verwendung von monoklonalen reifen OT-I Maus-T-Zellen als Spenderzellen verringert. Die OT-I T-Zellen wurden mit retroviralen Vektoren transduziert, die die Onkogene NPM-ALK, c-Myc und ΔTrkA exprimieren, und anschließend in Rag-1 -/- Empfängermäuse transplantiert. Alle transplantierten Mäuse entwickelten Leukämien/Lymphome. Die Rolle eines intrinsischen Faktors für den Transformationsprozess durch die Gegenwart von OT-I T-Zell Rezeptor- Transgens wurde wurde ausgeschlossen, da andere Onkogen-transduzierte monoklonale T-Zellen (P14 und OT-II) Tumore in Empfängermäusen verursachten. Weiterhin wurden in Kontrollgruppen von Mäusen, die mit eGFP-transduzierten OT-I, P14 und OT-II Zellen transplantiert wurden, keine Tumore festgestellt. Die Transformation von OT-I T-Zellen durch die Onkogene NPM-ALK and ΔTrkA konnte durch die ko-Transplantation polyklonaler BL6 T-Zellen als Kompetitoren verhindert werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die interklonale Kompetition zwischen verschiedenen T-Zell Klonen einen Mechanismus zur Kontrolle prä-leukämischer Klone darstellt, der ihrer Transformation vorbeugt. In diesem Modell benötigen prä-leukämische Klone Kontakte mit spMHC-Liganden, um Signale zu erhalten, die ihre Transformation fördern. In einer polyklonalen Situation haben prä-leukämische Klone einen erschwerten Zugang zu spMHC-Nischen und können nicht genügend Signale für Wachstum und Transformation erhalten. In einer monoklonalen Situation dagegen stehen in Abwesenheit polyklonaler Kompetitoren mehr freie spMHC-Liganden zur Verfügung, wodurch es zur verstärkten T-Zell Rezeptoraktivität in prä-leukämischen Klonen und T-Zell Transformation kommt. Im Gegensatz zu NPM-ALK and ΔTrkA führten c-Myc-transduzierte OT-I T-Zellen sogar in der Gegenwart von polyklonalen BL6 T-Zellen zur Tumorentstehung. Dies kann durch die verschiedenen Mechansimen erklärt werden, über die die drei Onkogene Tumore hervorrufen. NPM-ALK and ΔTrkA sind Oberflächenrezeptoren, welche ihren onkogenen Effekt durch das aktivieren von Wachstums- und Überlebenssignalwegen erzielen wogegen gezeigt wurde, dass die Deregulation von c-Myc eine Rolle bei der Induktion des Zellwachstum, dem Durchlaufen des Zellzyklus, Blockade der Zelldifferenzierung, Angiogenese und genomischer Instabilität spielt. c-Myc wird als einer der stärksten Aktivatoren der Tumorentwicklung betrachtet, der in verschiedensten Tumoren eine Rolle spielt. Aufgrund dieser Eigenschaften kann c-Myc die T-Zell-Transformation durch unterschiedliche Signalwege verursachen, die nicht von der Aktivität des T-Zell-Rezeptors abhängen, was die Fähigkeit von c-Myc erklären könnte, im Gegensatz zu NPM-ALK and ΔTrkA die interklonale Kompetition zu überwinden. Als humane mutierte Proteine können NPM-ALK and ΔTrkA von den ko-transplantierten BL6-Zellen als fremde Antigene erkannt werden, was zur Eliminierung der Onkogen-transduzierten OT-I T-Zellen und der Unterdrückung der Tumorentwichlung führen könnte. Diese Möglichkeit wurde jedoch ausgeschlossen, da die GFP-Markierungslevel der Onkogen-transduzierten OT-I T-Zellen in vivo stabil blieben und vergleichbar zur GFP-Expression vor der Transplantation waren, was auf das Überleben der OT-I T-Zellen hinweist. Weiterhin wurden polyklonale BL6-Zellen gegen ΔTrkA immun-tolerant gemacht und als Kompetitoren für ΔTrkA-transduzierte T-Zellen verwendet, wonach sie noch immer die T-Zell Transformation verhindern konnten. Studien zum T-Zell Transfer in TCR-transgene Empfänger zeigten eine hierarchische Ordnung der homöostatischen Proliferation für verschiedene T-Zell Klone mit unterschiedlichen MHC-Beschränkungen, in der OT-I T-Zellen in P14 Empfängern proliferieren konnten, jedoch nicht vice versa. Der adoptive Transfer von NPM-ALK transduzierten OT-I in P14 Mäuse rief in 2 von 7 Empfängern Leukämien/Lymphome hervor, was eine teilweise Behinderung der Tumorenstehung aufzeigt. Im Modell der hierarchischen Ordnung sind die OT-I Zellen in der Lage, in P14 Mäusen die spMHC-Nischen zu erreichen und können folglich proliferieren. Dennoch limitiert die Gegenwart der empfänger eigenen P14 T-Zellen die Verfügbarkeit anderer limitierender Ressourcen wie z.B. Zytokine für die OT-I T-Zellen und verringert die Proliferationsrate im Vergleich zu OT-I T-Zellen, die in Rag-1 -/- Empfänger transplantiert wurden. Entsprechend ist die Transformationsfähigkeit der NPM-ALK-transduzierten OT-I T-Zellen in P14-Empfängern schwächer als in Rag1 -/- Empfängern. Interessanterweise wurde die Transformation von NPM-ALK-transduzierten OT-I T-Zellen in OT-II-transgenen Empfängern vollständig verhindert. Bei OT-II handelt es sich um einen transgenen TCR, der auf MHC-II beschränkt ist, wogegen der OT-I TCR MHC-I erkennt, was die Abwesenheit von Kompetition zwischen OT-I und OT-II TCRs für spezifische spMHC-Nischen impliziert. Dennoch verhindert die Gegenwart von transgenen OT-II T-Zellrezeptoren in diesem Mausmodell nicht vollständig die Entwicklung von MHC-I spezifischen Zellen im Thymus sondern verringert ihren Anteil auf 25% der gesamten T-Zellen. Wegen ihrer hohen Anzahl wird angenommen, dass die MHC-I-beschränkten T-Zellen signifikant mit den Spender NPM-ALK-transduzierten OT-I T-Zellen konkurrieren und deren Transformation blockieren. Die Analyse der retroviralen Integrationsstellen in Tumorzellen ergab eine klare Präferenz für die Integration in offen Leserahmen, was schon zuvor in anderen Studien berichtet wurde. Durch c-Myc induzierte Tumore zeigten, im Vergleich zu den meist monoklonalen durch NPM- ALK and ΔTrkA induzierten Tumoren, ein oligoklonales Integrationsmuster. Weiterhin entwickelten sich die c-Myc Tumore relativ schnell, was durch die starke kanzerogene Aktivität von c-Myc erklärt werden kann. Die Monoklonalität der durch NPM- ALK and ΔTrkA induzierten Tumore impliziert, dass beide Onkogene ein kooperatives Ereignis benötigen, um einen Tumor zu erzeugen, was auch durch die Gegenwart von RISs or CISs in den die retroviralen Integrationsstellen umgebenden Genen in diesen Tumoren befürwortet wird. Im Gegensatz dazu scheint c-Myc deutlich potenter zu sein und kann die Tumorentstehung ohne die Notwendigkeit kollaborativer Ereignisse verursachen, was durch die Oligoklonalität der Tumore und die kurze Überlebensspanne der mit c-Myc transduzierten T-Zellen transplantierten Mäuse wiedergegeben wird. Die Kontrollgruppen von Empfängermäusen, die mit eGFP-transduzierten monoklonalen T-Zellen transplantiert wurden, überlebte den Beobachtungszeitraum, ohne maligne Erkrankungen zu entwickeln. Dies verdeutlicht, dass die retrovirale Integration alleine ohne die Gegenwart eines Onkogens keine Tumore in monoklonalen reifen T-Zellen verursacht und weist auf eine Resistenz monoklonaler T-Zellen gegen Insertionsmutagenese durch retrovirale Vektoren hin. Es werden jedoch längere Beobachtungszeiträume benötigt, um diese Vermutung zu belegen. Grundsätzlich erlaubt die geringe Anzahl der analysierten Integrationsstellen und der sie umgebenden Gene keine statistisch signifikante Schlussfolgerung. Das durch diese Studie erworbene Wissen lässt vermuten, dass die Konkurrenz zwischen verschiedenen T-Zell-Klonen für spMHC-Nischen als Kontrollmechanismus zur Vorbeugung gegen die Transformation Onkogen-transduzierter T-Zell Klone (präleukämischer Klone) dient. Dementsprechend bieten reife polyklonale T-Zellen für Gentherapie-Studien eine relativ sichere Alternative zu reifen monoklonalen T-Zellen.