Open Access

Jan Griesbach

• Nicotinic acid has been used in the clinical treatment of elevated blood lipid levels for over 50 years. Although it has a beneficial effect on myocardial infarction and blood lipid profiles, its widespread use has been hampered by side effects such as skin rashes and a burning sensation on the upper body. Since elevated blood lipid levels, especially ones of VLDL and LDL cholesterol are a frequent indication and high risk factor for coronary and cardiac diseases, finding a compound with an enhanced pharmacological profile, still holding the desired effects, but without inconvenient side effects, is a very appealing aim to many pharmaceutical companies. These efforts have already produced two marketed drugs, Acipimox and Acifran, but they have not been able to overcome the restrictions already imposed on the treatment by nicotinic acid. Although proposed long before, in the year 2000 the gene for the nicotinic acid receptor in mouse PUMA-G was cloned, and in 2003 the discovery of the genes HM74 and HM74A followed, which comprise the homologous low and high affinity receptors for nicotinic acid in humans. The discovery of this G Protein-coupled receptor target allowed a more directed approach for the search of alternative compounds. This work is the first report of the heterologous overexpression of the high affinity GPCR gene HM74A in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The protein product, NAR1, was pharmacologically characterized, and displayed a binding affinity of 224.8 nM to its ligand nicotinic acid, showing a similar activity profile compared to those displayed in human tissue, which were determined to be 60 nM to 90 nM. Additionally, inhibitory constants (Ki) for Acifran and Acipimox were determined to be 4.5 µM and 50.5 µM, respectively. Furthermore, the total yield of NAR1 reached 42 pmol/mg membrane protein, which corresponds to 0.4 mg of receptor produced per liter yeast culture, opening up the perspective of large scale protein production to facilitate high throughput screening drug discovery efforts and structural studies. In addition, NAR1 could be solubilized in n-decyl-β-D-maltopyranoside and purified to homogeneity after immobilized metal affinity chromatography and a second affinity chromatography step on immobilized monomeric avidin, yielding a single peak on gel filtration, while the purified receptor was able to bind ligand, as shown in NMR Saturation Transfer Difference (STD) measurements. It could be shown that NAR1 is desensitized by β-arrestin 1 in vivo in confocal microscopy studies on HEK and BHK cells. This finding provides a native binding partner for the stabilization of the receptor upon solubilization and purification. Finally human β-arrestin 1 could be produced as a constitutively active variant, comprising residues 1-382 in Pichia pastoris and Escherichia coli. The purified protein was used for in vitro binding experiments and shown to be capable of interacting with NAR1. Although the interaction and formation of the complex was only possible to a limited extent, it leaves open the perspective of crystallizing NAR1 in its active conformation, bound to nicotinic acid and β-arrestin 1.
• Nikotinsäure wird seid über 50 Jahren in der klinischen Therapie zur Senkung erhöhter Blutfettwerte verwendet. Trotz seines positiven Effekts auf Blutfettwerte und die Verbesserung der Prognose bei myokaridialem Infarkt wird die Anwendbarkeit der Therapie durch Nebenwirkung beeinträchtigt. Diese Nebenwirkungen sind durch Vasodilation, begleitet von deutlichem Erröten des Gesichts und Oberkörpers, sowie einem sonnenbrandähnlichen Gefühl. Erhöhte Blutfettwerte, bedingt durch VLDL-Cholesterol und LDL-Cholesterol, sind einer der häufigsten Risikofaktoren bei der Ausbildung von Koronar- und Herzerkrankungen. Deshalb ist die Entwicklung eines Wirkstoffes, der die gleichen erwünschten Effekte wie Nikotinsäure erzielt, aber keine oder verminderte Nebenwirkungen besitzt, ein Ziel vieler pharmazeutischer Unternehmen. Im Zuge dieser Anstrengungen wurden bereits Acifran und Acipimox entwickelt, jedoch ohne die bekannten Nebenwirkungen der Nikotinsäuretherapie im gewünschten Maße zu reduzieren. Obwohl die Existenz eines Rezeptors für Nikotinsäure schon lange postuliert wurde, gelang es erst im Jahr 2000 das murine Gen des Nikotinsäurerezeptors PUMA-G zu identifizieren und zu klonieren. Im Jahr 2003 folgte die Entdeckung des hoch affinen und niedrig affinen humanen Homologs HM74A und HM74. Die Entdeckung dieses G Protein-gekoppelten Rezeptors ermöglichte die gezielte Suche nach Verbindungen, die mit diesem Rezeptor interagieren. Diese Arbeit ist der erste Bericht über die heterologe Überexpression des Gens für den hoch affinen Nikotinsäurerezeptor HM74A in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris. Die pharmakologischen Eigenschaften des Proteinprodukts dieses Gens, mit der Bezeichnung NAR1, wurden eingehend charakterisiert. Zudem ist die Bindungskonstante KD bestimmt (KD = 224.8 nM) worden. Ebenso konnten die Inhibitionskonstanten KI für Acifran (KI = 4.5 µM) und Acipimox (KI = 50.5 µM) gemessen werden. Die Produktion von NAR1 konnte in P. pastoris optimiert werden und erreichte 42.1 pmol/mg Membranprotein. Dies entspricht einer Produktionsmenge von 0,4 mg NAR1 pro Liter Hefekultur. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich der Rezeptor in n-Decyl-β-D Maltopyranosid solubilisieren und durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie reinigen lässt. Zur Darstellung einer reinen Proteinprobe war jedoch ein zweiter chromatographischer Schritt notwendig. Hierzu ist immobilisertes monomeres Avidin als Affinitätsmatrix verwendet worden. Das auf diese Art gereinigte Protein lieferte ein distinktes Signal bei der Gelfiltration, das nicht nur von einem reinen sondern auch homogenen Protein zeugt. Die Aktivität des solubilisierten und gereinigten Membranproteins konnte mittels Saturierungs-Transfer-Differenz-Messungen mittels NMR belegt werden. Des weiteren konnte mittels konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass β-Arrestin 1 in vivo für die Desensitisierung von NAR1 zuständig ist. Die in HEK und BHK Zellen durchgeführten Studien haben β-Arrestin 1 als Bindungspartner für NAR1 verifiziert. Damit zeigt sich erstmalig die Möglichkeit, diesen Rezeptor durch Rekonstitution mit β-Arrestin 1 sowohl in der aktiven Konformation zu stabilisieren, als auch einen Versuch der Kokristallisierung durchzuführen. Dabei würde β-Arrestin 1 die Rolle von Antikörperfragmenten übernehmen können. Für β-Arrestin 1 ist konstitutiv aktive Variante beschrieben, die die Aminosäuren 1 bis 382 umfasst. Diese konnte in P. pastoris und Escherichia coli produziert werden. Mit dieser konstitutiv aktiven Variante und NAR1 wurden in vitro Bindungsstudien durchgeführt, welche belegen, dass beide Proteine in Lösung miteinander interagieren können. Trotz der ausbleibenden quantitativen Rekonstitution des Komplexes, ist hiermit dennoch der Weg zur Kristallisierung des Komplexes aus dem GPCR NAR1, dem Agonisten Nikotinsäure und β-Arrestin 1 geebnet.