Open Access

Till Scholz

• Die Hauptkomplikation (bis zu 30-50%) bei der Therapie von Gefäßeinengungen (Stenosen) nach invasiven Interventionen ist eine durch Verletzung des Gefäßes verursachte erneute Einengung (Restenose) der Gefäßstrombahn. Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) gehört zu einer Gruppe von 21 strukturell miteinander verwandten Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren, die auf eine Vielzahl verschiedener biologischer Prozesse wie Zellproliferation, -migration, Plasminogenaktivierung, Integrinexpression sowie embryonale Entwicklung und Differenzierung wirken. Insbesondere innerhalb der ersten 72 Stunden nach Gefäßwandverletzungen ist es an der Proliferationssteigerung glatter Gefäßmuskelzellen (SMC) und damit an der Entwicklung von Intimahyperplasie (IH) und Gefäßstenosen durch autokrine und parakrine Stimulation beteiligt. Photodynamische Therapie (PDT) hemmt IH und bewirkt hierbei eine vollständige Gefäßzelleradikation mit minimaler Repopulation der Media bei beschleunigter Reendothelialisierung. Weiterhin wird matrix-assoziiertes bFGF inaktiviert und dadurch die Mitoserate und Migration von SMC inhibiert, von Endothelzellen (EC) jedoch gesteigert. Um festzustellen, welchen Einfluß bFGF auf das Remodeling nach Verletzung der Gefäßwand und erfolgter PDT hat, untersucht die vorliegende in-vitro Studie Proliferation sowie bFGF-mRNA- Expression boviner aortaler EC und SMC nach PDT von isolierter extrazellulärer Matrix (ECM). Hierzu wurde ECM nach einer Standardtechnik in 6-Loch Zellkulturplatten hergestellt. Durch Bestrahlung des Farbstoffs Chloraluminium sulfoniertes Phthalocyanin (CASPc; 1 µg/ml) mit Licht (100 J/cm², 100 mW/cm², l=675 nm) wurde die Matrix photodynamisch behandelt. Nach Besiedlung der Matrices mit 2x105 EC bzw. SMC wurde die Proliferation 24, 48 und 72h durchflußzytometrisch bestimmt. Um die quantitative Bestimmung der bFGF mRNA Expression 12, 24 und 48h nach PDT zu realisieren, wurden erstmals die PCR-Bedingungen für b-Actin und bFGF der EC und SMC auf das LightCyclerä-System abgestimmt und etabliert. Die Proliferation von EC nach PDT wurde zu allen Zeitpunkten gegenüber EC auf unbehandelter ECM signifikant (p< 0,0004) stimuliert, die von SMC hingegen signifikant (p< 0,002) gehemmt. Die bFGF mRNA-Expression in EC nach PDT der ECM zeigte gegenüber EC auf unbehandelter ECM lediglich einen signifikanten (p< 0,005) Anstieg nach 24h. In SMC nach PDT der ECM konnten hingegen keine signifikanten Änderungen dokumentiert werden. Die Ergebnisse dieser Studie, legen den Schluß nahe, daß es durch einen PDT-Effekt der ECM zu einer akzelerierten Reendothelialisierung kommt. Die anhaltend verstärkte Proliferation der EC ist dennoch wahrscheinlich nicht allein dem vergleichbar kurzen Anstieg der bFGF mRNA-Expression zuzuschreiben. Die Abnahme der SMC-Proliferation nach PDT-Vorbehandlung der ECM läßt vermuten, daß bioaktive Stimuli für die Zellvermehrung ausgeschaltet worden sind. Da hier jedoch eine erhöhte bFGF Protein Konzentration (dies zeigte eine unveröffentlichte Studie unserer Arbeitsgruppe) ohne erhöhte bFGF mRNA Expression vorlag, läßt dies nur den Schluß zu, daß bFGF nicht oder nur in geringem Maße aus den SMC ausgeschleust werden konnte und es zu einer Hemmung der bFGF-vermittelten autokrinen Stimulation der SMC in diesem Modell kommt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die unterschiedliche intrazelluläre Beeinflußung der Gefäßzellfunktionen von EC und SMC durch PDT von ECM und eröffnen damit nicht nur weitere Aspekte zur Aufklärung der Mechanismen der vaskulären PDT, sondern könnten auch zum Verständnis verschiedener Interaktionen zwischen Zellen und deren unmittelbaren Umfeld beitragen.
• The developement of restenosis (up to 30-50%) caused by injury after invasiv vascular interventions remains a significant clinical problem. Basic fibroblast growth factor (bFGF) plays an important role for the proliferation of vascular smooth muscle cells (SMC) and the development of intimal hyperplasia, particularly within the first 72 hours following injury. Photodynamic therapy (PDT) is a technique to inhibit intimal hyperplasia (IH), being able to deplete vascular cells througout all layers of the vascular wall with a lack of repopularisation of the media and accelerated reendothelialization of the intima. Furthermore, matrix-associated bFGF is inactivated by PDT, mediating decreased mitosis and migration of smooth muscle cells (SMC) but increased mitosis and migration of endothelial cells (EC). This in vitro study was designed to determine proliferation, as well as bFGF-mRNA expression in bovine EC and SMC seeded on PDT-treated extracellular matrix (ECM) to elucidate the role of bFGF for the remodeling process following PDT. Endothelial cell-derived ECM was isolated in 6-well plates using a standard technique. Following 2h incubation with the photosensitizer chloroaluminum sulfonated phthalocyanine (CASPc; 1µg/ml) and irradiation with laser light emitted by a diode laser (fluence 100 J/cm²; irradiance 100 mW/cm²; l=675nm) EC respectively SMC were seeded at a density of 2x105 cells/well. Proliferation was assessed by fluorescence cell counting at 24, 48, and 72h. bFGF mRNA-expression was determined by establishing a quantitative PCR for b-Actin and bFGF on the LightCyclerä-System at 12, 24 and 48h respectively after PDT. EC proliferation on PDT matrix was significantly increased at all time intervals as compared to normal matrix (p< 0,0004), whereas SMC proliferation was significantly inhibited (p< 0,002). bFGF mRNA-expression of EC following PDT of ECM was increased versus KO at 24h only (p<0,005), whereas no changes were noted in PDT at all time points. The present data suggest that PDT-effects of ECM accelerated reendothelialisation. Althoug expression of bFGF-mRNA with autocrine stimulation of EC proliferation was initiated, this mechanism may not solely be responsible for a constant stimulation of EC proliferation following PDT. The Inhibition of SMC proliferation after PDT of ECM suggest that bioactive stimuli for the cellreproduction were eliminated. Unchanged bFGF-mRNA expression in conjunction with temporarily increased intracellular protein expression (unpublished data) suggests a decreased release of bFGF with subsequent inhibition of autocrine stimulation. However, the data of this study demonstrate altered vascular cell functions caused by PDT-induced changes in the ECM and opens a new line of investigation that may not only provide further insights into the mechanism of vascular PDT, but may also help to gain a better understanding of the various interactions between the cells and their immediate environment in vascular remodeling.