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Benjamin Rietschel

• Diese Dissertation befasst sich mit der massenspektrometrischen Analytik von Membranproteinen. Diese gestaltet sich aufgrund der hydrophoben Natur der Proteine und der damit verbundenen schlechten Löslichkeit in wässrigen Puffersystemen als deutlich schwieriger als die Untersuchung löslicher Proteine. Einige weitere Probleme entstehen durch die konsequente Verwendung der Referenzprotease Trypsin zur Hydrolyse der Proteine. Sie spaltet ausschließlich Peptidbindungen nach basischen Aminosäuren, die naturgemäß in den unpolaren Helixbereichen der Membranproteine nur vereinzelt anzutreffen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf weniger spezifischen Proteasen basierende Protokolle zur Analyse von ganzen Membranproteomen entwickelt, welche einige der ursprünglichen Probleme umgehen oder zumindest vermindern. Die Proteolysereaktion fand in Anwesenheit von Methanol statt, welcher die Membranstruktur destabilisiert und so die Zugänglichkeit der in die Membran eingebetteten Proteinteile für das Enzym erhöht. Zusätzlich erhöhte sich dadurch die Löslichkeit gebildeter hydrophober Peptide im Puffer. Das neue Protokoll wurde an Bacteriorhodopsin, einem geläufigen Modellsystem für α helikale Membranproteine, erfolgreich etabliert. Bei Verwendung der Proteasen Elastase und Pepsin konnten nach nLC-Trennung und MALDI-MS/MS deutlich mehr Peptide des Membranproteins signifikant identifiziert werden, als es mit Trypsin möglich gewesen ist. Auch qualitativ ergaben sich Unterschiede zwischen beiden Enzymen. Mit den alternativen Enzymen ließen sich nicht nur die hydrophilen peripheren Proteinabschnitte nachweisen, sondern auch zahlreiche Peptide aus den hydrophoben Transmembranbereichen. Das am Modellprotein etablierte Elastase-Protokoll konnte problemlos auf die Analyse des komplexeren Membranproteoms von Corynebacterium glutamicum transferiert werden. So konnten ca. 150 verschiedene Proteine identifiziert werden, darunter auch zahlreiche Membranproteine. Die erzeugten Peptidmischungen wurden nicht nur mittels nLC-MALDI-TOF/TOF sondern auch mit einer nLC-ESI-Orbitrap-Plattform analysiert. Anhand einer detaillierten Analyse der physikochemischen Eigenschaften der entstandenen Peptide konnte gezeigt werden, dass der dabei beobachtete Vorteil des ESI-Instrumentes zu großen Teilen auf die bessere Detektion aliphatischer Neutralpeptide zurückzuführen war. Diese werden bei der MALDI vornehmlich aufgrund der schlechteren Ionisation bei Verwendung der Standardmatrix α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure diskriminiert. Ein weiterer Vorteil des verwendeten ESI-Gerätes ist seine bessere Massengenauigkeit durch den hochauflösenden Orbitrap-Massenanlysator. Wurden die MALDI-TOF/TOF-Fragmentierungsdaten durch, auf einem zweiten Instrument gemessene, genaue MALDI-Orbitrap-Vorläufermassen supplementiert, konnten über 30% mehr Peptide signifikant identifiziert werden. Die gesammelten Daten konnten zur Erhebung einiger Statistiken über Elastase und Pepsin herangezogen werden. Erstmals wurde eine umfassende Untersuchung der Spaltspezifität von Elastase vorgenommen. Das Enzym hydrolysiert in ca. 82% der Fälle nach den kleinen hydrophoben Aminosäuren Ala, Val, Ile, Leu, Ser und Thr. Diese Spezifität ist für proteolytische Schnitte innerhalb der hydrophoben Helixbereiche von Membranproteinen äußerst vorteilhaft. Sie reicht aus, um Peptide Mass Fingerprinting an Einzelproteinen durchzuführen, wie exemplarisch am Modellprotein Bacteriorhodopsin gezeigt wurde. Die für Pepsin erhaltene Spezifität ist hingegen zu undifferenziert für solche Experimente, weshalb hier MS/MS-basierte Strategien vorzuziehen sind. Weitergehende Verbesserungen für Datenbanksuchen mit weniger spezifischen Proteasen wurden vorgeschlagen. Hierzu wurde erstmals eine größere Fragmentierungsstatistik eines nichttryptischen Datensatzes auf einem MALDI-Instrument erstellt, deren Aussage zur Verifizierung von Suchergebnissen in die Algorithmen implementiert werden kann. Beim Einsatz weniger spezifischer Proteasen erhöht sich im Vergleich zu Trypsin die entstehende Peptidkomplexität. Zur Kompensation dessen wurde eine Fraktionierung mittels Off-gel IEF vor der nLC-MALDI-Analyse etabliert. Zwecks direkter Kompatibilität zur nLC wurde ein Off-gel IEF-Protokoll ohne die Probeninjektion störendes Glycerol entwickelt. So ließ sich die dreifache Menge an Peptiden nachweisen, als mit ausschließlich eindimensionaler nLC-Trennung. In Verbindung mit den durch Trypsin erzielbaren Resultaten lassen sich mit den weniger spezifischen Enzymen viele Membranproteine umfassender charakterisieren, da zusätzlich die hydrophoben Transmembranbereiche und somit mehr Informationen für die Analytik zugänglich sind. Der gezielte Einsatz von alternativen Enzymen verbessert die momentane Situation in der Membranproteom-Analytik deutlich und führt diese einen weiteren Schritt an die Analytik löslicher Proteine heran.
• This PhD thesis focused on the mass spectrometric analysis of membrane proteins. Due to their poor solubility in aqueous solvents and their general hydrophobic nature, proteomic efforts to identify or characterize such proteins tend to be difficult. Further problems arise through the consequent application of the reference protease trypsin. This enzyme cleaves peptide bonds after the basic side chains of arginine and lysine, occurring only sporadically within the hydrophobic helical regions of membrane proteins. In this work, modified digestion protocols employing less-specific proteases were developed, to avoid or reduce at least some of the initial difficulties. Proteolysis was carried out in the presence of methanol, destabilizing the membrane integrity and facilitating the access of the protease towards the membrane-embedded protein regions. Additionally, the organic solvent increases the solubility of liberated hydrophobic peptides in the buffer medium. The novel protocol was successfully tested on bacteriorhodopsin, a common model system for α helical membrane proteins. By hydrolysis using the proteases elastase and pepsin, significantly more peptides of the membrane protein could be identified after nLC/MALDI-MS/MS analysis than with trypsin. In addition to peptides from the soluble protein parts, ample peptides were identified from the transmembrane regions, if the alternate enzymes were used. The established elastase protocol was transferred for the analysis of the more complex membrane proteome of Corynebacterium glutamicum, identifying more than 150 different proteins including various membrane proteins. The generated peptide mixtures were analyzed on MALDI-TOF/TOF and ESI-Orbitrap platforms, respectively. A detailed look on the peptide’s physicochemical properties revealed, that an obvious margin in favor of the ESI instrument could mainly be attributed to a better detection of aliphatic neutral peptides. These are heavily discriminated using MALDI due to their inefficient ionization, if the standard matrix α-cyano-4-hydroxycinnamic acid is used. An increased mass accuracy offered by the high-resolution Orbitrap mass analyzer is another advantage of the ESI instrument. If MALDI-TOF/TOF fragment data was supplemented by accurate MALDI-Orbitrap precursor masses measured on a second instrument, up to 30% more peptides were identified. All collected data was used to raise specificity definitions of elastase and pepsin. For the first time ever, a comprehensive large-scale analysis of the elastatic specificity was performed. The enzyme hydrolyzes to an extent of 82% after the small hydrophobic amino acids Ala, Val, Ile, Leu, Ser and Thr. This specificity is extremely useful to target the helical regions of membrane proteins. It is sufficient to perform peptide mass fingerprinting on single proteins, as was shown on bacteriorhodopsin. However, the specificity of pepsin is too undifferentiated for such experiments, so MS/MS-based strategies are suggested with this protease. Further improvements for less-specific database searches were discussed. For that reason, comprehensive fragmentation statistics were generated from the non-tryptic MALDI datasets. Their results could be used to verify search results, if implemented in the current algorithms. Application of less-specific enzymes always increases the generated peptide complexity compared to tryptic digests. To compensate this, pre-fractionation by means of off-gel IEF prior to nLC/MALDI analysis was performed. The additive glycerol was omitted from the protocol to allow the direct injection of the off-gel fractions into the nLC. The additional pre-fractionation step increased the number of identified peptides by a factor of 3. By employing less-specific enzymes membrane proteins can be analyzed more efficiently especially in combination with tryptic results. This can be mainly attributed to the access of the transmembrane regions, yielding additional information about the proteins. The targeted application of less-specific enzymes alleviates the current situation and closes the gap between membrane protein analysis and the soluble proteins.