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Sepandarmaz Aschrafi

• P2X receptor subunits assemble in the ER of Xenopus oocytes to homomultimeric or heteromultimeric complexes that appear as ATP-gated cation channels at the cell surface. In this work it was intended to investigate the posttranslational modifications such as N-linked glycosylation and disulfide bond formation that is undergone by P2X1 receptors. In addition, the aim of this study was to examine the expression and the quaternary structure of selected P2X receptor isoforms in Xenopus oocytes. The investigation of the quaternary structure of the metabolically or surface labeled His-P2X2 receptor by BN-PAGE revealed that, while the protein complex is only partially assembling in oocytes, the plasma membrane form of the His-P2X2 receptor assembled into trimeric and even hexameric complex as was shown by the BN-PAGE analysis. Besides this finding, it is shown that the His-P2X5 protein that was purified from metabolically or surface labeled oocytes appeared as one single band corresponding to a trimer when analyzed by BN-PAGE. The present study signified that His-P2X6 alone does not reach a defined assembly status and possibly needs the hetero-polymerisation with other P2X subunits to assemble properly for insertion into the plasma membrane. Another finding of this study is that the P2X1 and P2X2 subunits could exist as heteromultimeric protein complexes in the plasma membrane of cells. Purification of surface expressed His-P2X2 subunit allowed the detection of co-injected P2X1 subunit and vice versa in Xenopus oocytes. Incubation with glutardialdehyde led to the cross-linking of P2X2 and P2X1 subunits to dimers and trimers. BN-PAGE analysis of the P2X2/P2X1 complex isolated under nondenaturing conditions from surface-labeled oocytes yielded one distinct band corresponding to a trimeric complex. The analysis of a C-terminally GFP tagged His-P2X1 fusion protein by confocal fluorescence microscopy revealed small clusters of the protein complexes, approximately 4-6 µm in diameter from a diffuse distribution of the protein in the plasma membranes of Xenopus oocytes. The cross-linking or BN-PAGE analysis of the fusion protein resulted in proteins that migrated quantitatively as trimers when purified in digitonin. The analysis of some chimeric constructs confirmed the results of others, which showed that desensitization can be removed from the P2X1 or P2X3 receptor by providing the N-domain from the P2X2 receptor (Werner et al., 1996) The exchange of this domain did not alter the quaternary structure of the chimeras, which showed to be present as trimers when expressed in oocytes. In addition, glycan minus mutants of His-P2X1 receptor were analyzed to examine whether carbohydrate side chains are important for P2X1 subunit assembly, surface expression, or ligand recognition. SDS-PAGE analysis of glycan minus mutants carrying Q instead of N at five individual NXT/S sequons reveals that 284N remains unused because of a proline in the 4 position. The four other sites (153Asn, 184N, 210N, and 300N) carry N-glycans, but solely 300N acquires complex-type carbohydrates. Like parent P2X1 receptor, glycan minus mutants migrate as homotrimers when resolved by blue native PAGE. Recording of ATP-gated currents revealed that elimination of 153N or 210N diminishes or increases functional expression levels, respectively. In addition, elimination of 210N causes a 3-fold reduction of the potency for ATP. If three or all four N-glycosylation sites are simultaneously eliminated, formation of P2X1 receptors is severely impaired or abolished, respectively. It is concluded that at least one N-glycan per subunit of either position is absolutely required for the formation of P2X1 receptors. The SDS-PAGE analysis of surface-labeled His-P2X2 and His-P2X5 receptors revealed that, while the His-P2X2 subunit acquires three complex-type carbohydrates, in case of His-P2X5 polypeptide, only two of the three N-glycans could obtain complex-type carbohydrates during transit of the Golgi apparatus. Furthermore, it was shown that DTT treatment blocked the appearance of newly made His-P2X1 at the plasma membranes of Xenopus oocytes. Also, it was revealed that the effects of DTT on His-P2X1 biogenesis are fully reversible. Removal of the reducing agent leads to subsequent folding and assembly into His-P2X1 receptor complex, followed by transport to the cell surface. The characterization of cysteine minus mutants by SDS PAGE and BN-PAGE demonstrated that, the cysteine substitution in the first cysteine rich domain (C1 - C6) does not have a major effect on assembly for the mutant receptors. In contrast, the replacement of the four cysteine residues (C7 - C10) from the second cysteine rich domain demonstrate a critical importance of this domain for the functional surface expression of P2X1 receptor. The investigations of several double cysteine mutants revealed that according to a similarity in the sensitivity to ATP, the C1 and C6, as well as C2 and C4 and finally C3 and C5 are pairs forming two disulfide bonds in each P2X1 subunit.
• P2X-Rezeptoren stellen ligandengesteuerte Ionenkanäle dar, die nach ATP-Bindung innerhalb weniger Millisekunden eine intrinsische Pore öffnen, die nicht-selektiv permeabel für kleine Kationen ist. Ziel meiner Arbeit war es, Tertiär- und Quartärstruktur der P2X-Rezeptoren mit molekularbiologischen Methoden zu charakterisieren. Hierbei wurde der Einfluss von Kohlenhydrat-Seitenketten und die Rolle der Disulfidbrücken auf die Expression und Assemblierung des P2X1-Rezeptors untersucht. Die Analyse der Quartärstruktur von metabolisch markierten His-P2X2-Rezeptoren ergab, dass die Proteinkomplexe nach der Expression in Oozyten hauptsächlich als Dimere und Trimere vorliegen. Zusätzlich wies ein Teil der isolierten Proteine keinen definierten Oligomerisierungszustand auf, was darauf hindeutet, dass His-P2X2 in intrazellulären Kompartimenten der Oozyten nicht vollständig assembliert. Die Untersuchung von plasmamembranständigen His-P2X2-Rezeptorkomplexen mittels BN-PAGE zeigte neben Proteinbanden für eine trimere Struktur auch Banden, die einer hexameren und einer nanomeren Strukturen entsprechen könnten. Die BN-PAGE-Analyse von P2X5-Rezeptoren, die heterolog in Ooyzten exprimiert wurden, ergab, dass die Rezeptoren sowohl intrazellulär als auch an der Zelloberfläche hauptsächlich als Trimere vorliegen. Ferner wurde in den Untersuchungen gezeigt, dass die His-P2X6-Rezeptoren hauptsächlich als hochmolekulare Komplexe erscheinen und somit keinen definierten Oligomerzustand aufweisen. Diese Resultate deuten daraufhin, dass die P2X6-Rezeptoruntereinheit nicht imstande ist, einen homo-oligomeren Ionenkanal zu bilden, und auf die Assemblierung mit anderen P2X- Rezeptoruntereinheiten angewiesen ist. Ein weiteres Ziel meiner Arbeit war der proteinchemische Nachweis der Bildung von P2X1 und P2X2 Heteromultimeren durch Koisolierung. Die cRNA für diese zwei P2X-Isoformen mit oder ohne der jeweiligen Hexahistidiylsequenz wurden in Xenopus-Oozyten injiziert und die Proteine nach entsprechender radioaktiver Markierung mittels Ni2 -Chelat-Chromatographie koisoliert. Die Untersuchung ergab, dass die binäre Kombination von P2X1 und P2X2 zur Bildung von stabilen Heteromultimeren führt. Des weiteren wurde mit Hilfe von Cross-linking-Experimenten und BN-PAGE-Analyse gezeigt, dass diese Proteinkomplexe eine trimere Struktur aufweisen. Um die zelluläre Lokalisation des P2X1-Rezeptors zu bestimmen, wurden die Xenopus-Oozyten mit der cRNA eines gentechnisch hergestellten Fusionsproteins, bestehend aus dem P2X1-Rezeptor und dem grünfluoreszierenden Protein (GFP), injiziert. An intakten Oozyten erkennt man in den fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen eine Fluoreszenz an der Plasmamembran, sowie kleine, etwa 4-6 µm große Vesikel unterhalb der Plasmamembran. Die Quartärstrukturanalyse dieses Proteins mittels Cross-linking-Experimenten und BN-PAGE ergab, dass dieses Fusionsprotein wie der Wildtyp-P2X1-Rezeptor eine trimere Struktur besitzt. Proteinchemische Analysen der durch gerichtete Mutagenese hergestellten Glycan-Minus-Mutanten des His-P2X1 Rezeptors zeigten, dass (1) 284N keine Kohlenhydrat-Seitenkette trägt, weil ein Prolin (287P) auf das Glykosylierungsmotiv N-L-S folgt; (2) dass nur die Oligosaccharid-Seitenkette an 300N auf dem Weg des trimeren Rezeptors an die Plasmamembran im Golgi-Apparat komplex-glykosyliert wird; (3) dass die Deletion von zwei Glykosylierungsstellen gut toleriert wird, dass aber bei der Deletion von drei Stellen die Expression drastisch abnimmt, und (4) dass bei der Deletion aller vier Stellen weder intrazellulär noch an der Plasmamembran P2X1-Rezeptoren nachweisbar sind. Elektrophysiologisch zeigte sich, dass die Mutation N210Q eine Abnahme der scheinbaren ATP-Affinität um den Faktor drei gegenüber dem Wildtyp-P2X1 bewirkt, die vermutlich auf dem Ausbleiben der N-Glykosylierung in dieser Position beruht. Ferner zeigte die proteinchemische Analyse des His-P2X2-Rezeptors durch SDS-PAGE, dass alle drei Kohlenhydrat-Seitenketten des P2X2-Rezeptors auf dem Weg zur Plasmamembran in die komplex-glykosylierte Form überführt werden, unterdessen aber nur zwei der drei Kohlenhydrat-Seitenketten der P2X5-Rezeptoruntereinheit auf dem Weg zur Plasmamembran in die komplex-glykosylierte Form überführt werden. Untersuchungen zur Rolle der Disulfidbrücken bei der Expression und Assemblierung von P2X-Rezeptoren ergaben, dass die P2X1-Rezeptoruntereinheit offenbar über zwei Cysteinfaltungsdomänen, CRD1 und CRD2, verfügt. CRD1 umfasst die N-terminal gesehen ersten sechs Cysteine, CRD2 die letzten vier Cysteine der Ektodomäne. Die Disulfidbrücken in CRD1 scheinen redundant angelegt zu sein, da hier der Austausch eines einzelnen Cysteins gegen Serin keinen nennenswerten Einfluss auf die Expression und Assemblierung hat. Bei Mutationen von Cysteinen im CRD2-Bereich kommt es dagegen zu massiven Störungen der Assemblierung. Aufgund der Ähnlichkeit der ATP-Emfindlichkeit bei den untersuchten Cysteindoppelmutanten lässt sich schlussfolgern, dass zwischen den Cyteinresten C1 und C6, C2 und C4 sowie zwischen C3 und C5 Disulfidbrücken gebildet werden.