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Wiebke Geisel

• Die Gruppe der T-Lymphozyten beinhaltet je nach Ausprägung des T-Zell-Rezeptors zwei Zell-Populationen, die der Alpha-beta- beziehungsweise der Gamma-delta-T-Zellen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Gamma-delta-T-Zellen, da sie eine außerordentlich interessante und wenig erforschte Zellgruppe darstellen. Die Beobachtung einer bevorzugten Anreicherung von Gamma-delta-T-Zellen auf mukosalen Oberflächen, die mit einer Vielzahl von Antigenen konfrontiert sind, hat zur Hypothese geführt, dass Gamma-delta-T-Zellen eine "erste Garde der Immunabwehr" bilden. Des weiteren geben zahlreiche Studienergebnisse Hinweise darauf, dass Gamma-delta-T-Zellen an der Pathogenese vieler Krankheiten, wie z. B. den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, beteiligt sind. Als Mitglied des Immunsystems scheinen Gamma-delta-T-Zellen nicht nur Funktionen sowohl der angeborenen als auch der erworbenen Immunabwehr wahrzunehmen, sondern auch eine Vermittlerrolle zwischen beidem zu spielen. Mit der Intention, ein grosses Tiermodel zu etablieren, um anhand dessen die Beeinflussbarkeit der Gamma-delta-T-Zellen durch die Alterung und durch mikrobielle Faktoren besser analysieren zu können, wurde in vorhergehenden Studien die postnatale Entwicklung des Gamma-delta-T-Zell-Rezeptor(TCR)-Repertoires des Schweins charakterisiert und der von Menschen als sehr ähnlich befunden. Somit war die Verwendung des Schweins als Tiermodell zur weiteren Erforschung der Gamma-delta-T-Zellen gerechtfertigt. In dieser Arbeit richteten wir unser Augenmerk zum einen auf die pränatale Entwicklung des TCR-delta-Repertoires des Schweins, zum anderen darauf, welchen Einfluß Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire des Schweins nehmen. Auf diese Weise sollte die Frage beantwortet werden, ob Fremd- oder Eigenantigene die Selektion und konsekutive Expansion bestimmter Gamma-delta-T-Zellklone in der Postnatalperiode bedingen. Hinsichtlich dieser Fragestellungen führten wir Experimente mit unterschiedlichen Gewebeproben des Schweins durch. Für die Untersuchung der pränatalen Entwicklung des TCR-delta-Repertoires verwendeten wir Gewebeproben von Schweinefeten unterschiedlichen Alters (38.Tag bis 114. Tag der Tragzeit), die aus den verschiedenen Organen stammten: Dünn- und Dickdarm, Leber, Milz und Thymus. Zusätzlich wurden Zellen des Knochenmarks und des peripheren Blutes untersucht. Für die Untersuchungen zum Einfluß durch Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire dienten uns Proben von 10 Wochen alten Schweinen, die unter keimfreien (GF) bzw. spezifisch-Pathogen-freien (SPF) Bedingungen aufgezogen wurden. Die Proben wurden aus Dünn- und Dickdarm, mesenterialen Lymphknoten, Milz und Thymus entnommen. Die Amplifikation der TCRDV1-DV5 Transkripte erfolgte mittels RT-PCR, woran sich eine längenabhängige Auftrennung durch denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (CDR3 Längenanalyse) anschloß. Einzelne dominante Banden wurden aus den Gelen ausgeschnitten, reamplifiziert, teilweise kloniert und anschließend sequenziert. Unsere Experimente zur pränatalen Entwicklung ergaben, daß das TCR-delta-Repertoire während der frühen Fetalzeit eingeschränkt war und bei Geburt Polyklonalität aufwies. Die durchschnittliche CDR3 Länge der Transkripte nahm während der Ontogenese zu, was auf eine zunehmende Aktivität des Enzyms TdT schließen läßt. Die zentrale Entdeckung dieser Versuche stellt das invariable DV3 Transkript dar, das in allen Feten während der frühen Gestation (38. Tag der Tragzeit) bis hin zur Geburt (114. Tag der Tragzeit) vorhanden war. Während der Mitte der Gestation, etwa um den 55. Tag der Tragzeit, dominierte dieses invariable DV3 Transkript alle analysierten Organe. Gegen Ende der Gestation, also etwa vom 90. Tag bis zum 114. Tag der Tragzeit, verlor dieses Trankript an Dominanz. Gleichzeitig wurde es aber noch häufig in peripheren Organen wie dem Darm und der Milz gefunden. Im Thymus hingegen konnte es zu dieser Zeit nicht mehr nachgewiesen werden. Diese Beobachtung läßt vermuten, daß die invariable DV3 Kette gegen Ende der Gestation im Thymus nicht mehr länger entsteht, wohingegen Gamma-delta-T-Zellen, die diese invariable Kette tragen, in der Peripherie "überleben". Die Tatsache, daß kein anderes invariables TCR-delta-Transkript, welches in verschiedenen Feten präsent gewesen wäre, identifiziert werden konnte, führt zur Annahme, daß den Gamma-delta-T-Zellen, die diesen Rezeptor expremieren, eine einzigartige Rolle zukommen könnte. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die pränatale Entwicklung des TCR-delta-Repertoires des Schweins dem des Menschen ähnlich ist. Es ist jedoch anzumerken, daß beim Menschen kein TCR-delta-Transkript existiert, das das fetale Repertoire in gleicher Weise dominiert. Es bedarf weiterer Untersuchungen in der Zukunft, um die Frage zu klären, ob es sich bei dem invariablen DV3 Transkript des Schweins um das Ergebnis eines vorprogrammierten Rearrangements und/oder einer Selektion durch Eigenantige handelt, ferner, welche wichtige Funktion es während der fetalen Entwicklung erfüllt. Unsere Untersuchungen zum Einfluß durch Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire ergaben keine signifikante Differenz zwischen dem postnatalen TCR-delta-Repertoire von 10 Wochen alten keimfreien (GF) bzw. spezifisch-Pathogen-freien (SPF) Schweinen und dem bereits in Vorarbeiten beschriebenen Repertoire von gleichaltrigen konventionellen Schweinen. Diese Beobachtung veranlasst zur Annahme, daß eine Selektion bestimmter Gamma-delta-T-Zellen eher durch Eigenantige als durch Fremdantigene (z. B. Mikroorganismen) hervorgerufen werden könnte.
• T cells can be classified in two different groups, according to their expressed T-cell-receptor: the major group consists of Alpha-beta-T-cells and the minor one of Gamma-delta-T-cells. This study deals with Gamma-delta-T-cells, as they represent an interesting cell-group, on which only limited data are available. Gamma-delta-T-cells being disproportionally accumulated at mucosal sites, an area which is faced to a variety of antigens, are thought to form a first line of defence. In addition, several studies support the notion that Gamma-delta-T-cells play a key role in the pathogenesis of many diseases, for example the Inflammatory Bowel Disease (IBD). As a member of the immunsystem, Gamma-delta-T-cells seem to contribute to the innate and acquired immunity; furthermore they function as a link betweeen the former and the latter. In order to establish a large animal model for analyzing the effects of age and microbial factors on Gamma-delta-T-cells previous studies characterized the postnatal development of the porcine Gamma-delta-T-cell-receptor(TCR)-repertoire. These experiments revealed similarities between the ontogeny and the the restriction of the porcine and the human TCR-delta-repertoire indicating that the pig can be used as a good animal model for extending the knowledge about Gamma-delta-T-cells. Our experiments focused on the prenatal development of the porcine TCR-delta-repertoire and additionally on the influence upon the postnatal porcine TCR-delta-repertoire caused by microorganisms. The question to be answered is if foreign or self-antigen is responsible for selection and consequent expansion of certain Gamma-delta-T-cells in the postnatal period. In order to analyze the prenatal development of the TCR-delta-repertoire specimens from fetal piglets of different age (between 38 and 114 days of gestation) were obtained: small and large intestine, spleen, thymus, liver, bone marrow and peripheral blood monocyte cells. Experiments concerning the influence upon the postnatal TCR-delta-repertoire caused by microorganisms were performed by using samples from 10 week old pigs which had been raised under germfree (GF) respectively specific-pathogen-free (SPF) conditions. Tissue samples derived from small and large intestine, mesenteric lymph nodes, spleen and thymus. TCRD1-DV5 transcripts were amplified by RT-PCR and size separated by denaturating PAGE. Individual dominant bands were excised from the gels, reamplified and sequenced. In some cases cloning was necessary before sequencing. Our experiments concerning the prenatal development revealed, that the porcine TCR-delta-repertoire was restricted early at gestation and polyclonal at birth. In addition, the average CDR3 length increased with ontogeny which suggests an increasing activity of the enzyme TdT. The central finding of this study is the invariant DV3 transcript which was present in all fetuses from early gestation (day 38 of gestation) until birth (day 114 of gestation). At mid gestation, around day 55 of gestation, this invariant DV3 transcript dominated all organs analyzed. At the end of gestation around day 90 to 114 this transcript was less dominant but still frequently found in peripheral organs like the intestine and spleen. However, it was absent in the thymus, suggesting that at the end of gestation the invariant DV3 chain is no longer rearranged in the thymus whereas Gamma-delta-T-cells carrying this invariant chain "survive" in the periphery. No other dominant TCR-delta-transcript, which was present in different fetuses, could be identified, suggesting a unique role for Gamma-delta-T-cells expressing this receptor. In conclusion, the prenatal development of the porcine TCR-delta-repertoire resembles that of humans. However, in humans there is no TCR-delta-transcript which dominates the fetal repertoire. Further studies should be performed to give answer to the question, if the invariant DV3 transcript is the result of programmed rearrangement and/or of selection by (self-)antigens, additionally, which function this transcript during the fetal development has. Our experiments concerning the influence upon the postnatal TCR-delta-repertoire caused by microorganisms revealed that there is no significant difference between the postnatale TCR-delta-repertoire of the 10 week old germfree (GF) respectively specific-pathogen-free (SPF) pig and the TCR-delta-repertoire of a conventionelly raised pig of the same age which has been described in previous studies. This finding suggests that the selection of certain Gamma-delta-T-cells is caused by self-antigens rather than by foreign antigens such as microorganisms.