ß-amyloid-mediated mitochondria-dependent cell death pathways in Alzheimer's disease

ß-Amyloid-vermittelte, Mitochondrien-abhängige Zelltodmechanismen in der Alzheimer Demenz

Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder marked by progressive loss of memory and cognitive ability. The pathology of AD is characterised by the presence of amyloid plaques, intracellular ne
Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder marked by progressive loss of memory and cognitive ability. The pathology of AD is characterised by the presence of amyloid plaques, intracellular neurofibrillary tangles and pronounced cell death. The aim of this thesis was to investigate pathways involved in the Aß cascade of neurodegeneration. Since novel findings indicate that already this Aß species exerts neurotoxic effects long before hyperphosphorylated tau, neurofibrillary tangles and extracellular Aß plaques appear, the investigations were accomplished with specific regard to the effects of intracellular Aß. The Swedish double mutation in the APP gene results in six- to eightfold increased Aß production of both Aß1-40 and Aß1-42 compared to human wildtype APP cells (APPwt). Data obtained from PC12 cells indicate that it is possible to specifically increase the Aß load without enhancing APP expression levels. On the basis of these findings, it seemed possible to investigate dose-dependent effects of Aß in multiple experimental designs. These assay designs were created in order to mimick different in-vivo situations that are discussed to occur in AD patients: APPsw PC12 cells exhibit low physiological concentrations of Aß within picomolar range in contrast to APPsw HEK cells, expressing Aß levels within the nanomolar range. Of note, the APPsw HEK cells showed a specific and highly significant increase in the intracellular accumulation of insoluble Aß1-42. Moreover, an intracellular accumulation of Aß and APP was found in the mitochondria of the HEK APPsw cells suggesting a direct impact on mitochondrial function on these cells. This effect might finally lead to disturbances in the energy metabolism of the cell or to increased cell death. Furthermore, baseline g- and ß-secretase activity was assessed since these enzymes represent promising therapeutic targets to slow or halt the disease process. As expected, ß-secretase activity was significantly elevated in all APPsw cell lines. This might be due to the proximity of the Swedish double mutation next to the N-terminus of the Aß sequence. Interestingly, g-secretase activity was similarly increased in PC12 APPsw cells. In addition, the toxicity of different Aß species was investigated in SY5Y and PC12 cells with regard to their effect on cellular viability mirrored by mitochondrial activity using MTT assay. Here, it turned out that not monomers, but already dimers are neurotoxic correlates. Fibrillar Aß species showed the highest toxicity. In the next step, SY5Y cells forming endogenous, dimeric APP and Aß were investigated. In accordance with previous findings, these cells showed a decreased MTT reduction potential in comparison to APPwt and control SY5Y cells reflecting a decrease of cellular viability. The impaired energy metabolism of the cells was even more drastically mirrored by reduced baseline ATP levels. In the second part of this thesis, the expression and intracellular distribution of Bcl-2 family proteins and pro-apoptotic mitochondrial factors under baseline conditions and during oxidative stress were analyzed in the APPwt and APPsw bearing cells. The most prominent finding was the reduction of expression levels of the anti-apoptotic factor Bcl-xL in the cytosolic fractions of APPwt and APPsw PC12 cells. This might indicate that a lack of anti-apoptotic factors or their altered intracellular distribution, rather than an increase in caspase-dependent pro-apoptotic factors, could be responsible for the increased vulnerability of APPwt- and APPsw-transfected PC12 cells against oxidative stress. Since total Bcl-xL expression was unaffected in PC12 cells, in contrast to APPwt and APPsw-expressing SY5Y and HEK cells revealing significantly decreased Bcl-xL expression levels. Thus, alterations in Bcl-xL distribution seem to be an early event in the disease process. Increasing Bcl-xL expression might potentially be one promising strategy for AD modification. PC12 and HEK cells bearing APPsw or APPwt were treated with the potent g-secretase inhibitor DAPT. Of note, DAPT did not only efficiently block Aß production, but additionally led to an elevation of the MTT reduction potential, reflecting an increase in cellular viability. As another disease-modifying strategy, several efforts are undertaken to ameliorate AD-relevant symptoms by the treatment with nerve growth factor (NGF). Generally, it is known that substituted pyrimidines have modest growth-promoting effects. Here, KP544, a novel substituted pyrimidine, was characterised. This drug increased MTT reduction potential in terminally differentiated and undifferentiated PC12 cells. Furthermore, treatment with KP544 led to a reduction in Aß1-40 secretion. Thus, one may conclude that the target of KP544, GSK-3ß, represents a connecting link between the two main pathological hallmarks of AD and might thus be a very promising therapeutic target for AD.
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Alzheimer Demenz (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung, welche durch einen kontinuierlichen Verlust der Gedächtnisleistung und der kognitiven Fähigkeiten charakterisiert ist. Das Ziel dieser Arbeit war die 
Alzheimer Demenz (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung, welche durch einen kontinuierlichen Verlust der Gedächtnisleistung und der kognitiven Fähigkeiten charakterisiert ist. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung zellulärer Signaltransduktionswege, die an der Amyloidkaskade beteiligt sind. Im ersten Teil der Arbeit wurde die APP-Prozessierung und Aß-Produktion in verschiedenen in-vitro-Modellen untersucht. PC12-, HEK- und SY5Y-Zellen, die stabil mit der Schwedischen APP-Doppelmutation (APPsw) und mit wildtyp APP (APPwt) transfiziert wurden, dienten als Zellkulturmodelle. Die Schwedische Doppelmutation auf dem APP-Gen führt zu einer sechs- bis achtfach erhöhten Produktion von Aß1-40 und Aß1-42 im Vergleich zu APPwt-Zellen. Anhand der Daten aus PC12-Zellen konnte abgeleitet werden, dass durch diese Mutation die sekretierten Aß-Spiegel ohne Beeinflussung der APP-Expression gesteigert werden. Basierend auf diesem Ergebnis erscheint es zumindest möglich, dosisabhängige Aß-Effekte in verschiedenen experimentellen Ansätzen zu untersuchen. Diese Versuchsdesigns sollten möglichst authentisch verschiedene Stadien in Alzheimer-Gehirnen abbilden: Beispielsweise dient das APPsw PC12-Zellmodell als Modell für niedrige physiologische Aß-Konzentrationen im picomolaren Bereich, im Gegensatz zu APPsw HEK-Zellen, die Aß-Spiegel im nanomolaren Bereich zeigen. APPsw HEK-Zellen zeigten eine spezifische und hochsignifikante Anreicherung von unlöslichem Aß1-42 im intrazellulären Kompartiment. Außerdem wurde eine Akkumulation von Aß und APP in Mitochondrien von APPsw HEK-Zellen beobachtet. Dies läßt eine direkte Beeinflussung mitochondrialer Funktionen vermuten, welche letztendlich zu Störungen im Engergiehaushalt der Zelle und zu gesteigertem Zelltod führen könnte. Die Toxizität verschiedener Aß-Spezies wurde in SY5Y- und PC12-Zellen im Hinblick auf die zelluläre Viabilität, dargestellt durch die Messung der mitochondrialen Aktivität im MTT-Assay, untersucht. Hier zeigte sich, dass nicht Monomere, sondern Dimere erste toxische Korrelate darstellen, und dass fibrilläres Aß die höchste Toxizität aufweist. Im nächsten Schritt wurden SY5Y-Zellen untersucht, die dimeres APP und Aß bilden. In Übereinstimmung mit anderen Daten besaßen diese Zellen im Vergleich zu APPwt und Kontroll-Zellen ein erniedrigtes MTT-Reduktionspotential und somit eine reduzierte zelluläre Viabilität. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression und die intrazelluläre Verteilung von Proteinen der Bcl-2-Familie und pro-apoptotischer mitochondrialer Faktoren untersucht. Die Proteine wurden unter basalen Bedingungen und unter oxidativem Stress in APPwt und APPsw Zellen untersucht. Interessanterweise sind die Expressionsspiegel des anti-apoptotischen Faktors Bcl-xL in zytosolischen Fraktionen von APPwt und APPsw Zellen erniedrigt. Dies könnte darauf hinweisen, dass ein Mangel an anti-apoptotischen Faktoren oder ihre veränderte intrazelluläre Verteilung, eher noch als eine Erhöhung caspase-abhängiger, pro-apoptotischer Faktoren, für die gesteigerte Empfindlichkeit der APPwt- und APPsw-transfizierten Zellen gegenüber oxidativem Stress verantwortlich ist. Eine Erhöhung der Bcl-xL-Expression eine potentielle krankheitsmodulierende Strategie darstellen. PC12- und HEK-Zellen wurden mit dem potenten g-Sekretase-Inhibitor DAPT behandelt. Die Behandlung mit DAPT führte nicht nur zu einer effizienten Hemmung der Aß-Produktion, sondern auch zu einer Steigerung des MTT-Reduktionspotentials. Es wurden schon einige Versuche unternommen, AD-relevante Symptome durch die Behandlung mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) zu behandeln. In dieser Arbeit wurde KP544, ein neuartiges substituiertes Pyrimidin, näher charakterisiert. Der genaue Wirkmechanismus von KP544 ist unbekannt. Die Behandlung mit KP544 führt zu einer Steigerung des MTT-Reduktionspotentials in undifferenzierten und differenzierten PC12-Zellen sowie zu einer verminderten Aß1-40-Sekretion. Zusätzlich wurde eine Inaktivierung der Glykogen-Synthase-Kinase-3ß (GSK-3ß) in Gegenwart von KP544 beobachtet. Dieser Befund ist sehr interessant, da GSK-3ß nicht nur die APP-Prozessierung, sondern auch die Hyperphosphorylierung von Tau, einem weiteren Merkmal der Alzheimer Demenz, moduliert. Daher könnte man schlussfolgern, dass das Target von KP544, GSK-3ß, ein Bindeglied zwischen den zwei Hauptmerkmalen der Alzheimer Demenz darstellt und somit ebenfalls ein sehr interessanter therapeutischer Angriffspunkt darstellt.
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Metadaten
Author:Astrid Waltraud Bonert
URN:urn:nbn:de:hebis:30-30558
Referee:Anne Eckert
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2006/09/11
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/07/13
Release Date:2006/09/11
Tag:Bcl-2 Proteine; Krankheitsmodulierende Strategien; Mitochondrien; Sekretase Inhibitoren; Substituierte Pyrimidine
Alzheimer´s Disease; Bcl-2 Family Proteins; Disease-modifying strategy; Secretase Inhibitors; Substituted Pyrimidines
SWD-Keyword:Alzheimer-Krankheit ; Apoptosis ; Nervendegeneration ; Oxidativer Stress; Wachstumsfaktor
HeBIS PPN:181022249
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $