Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN

Induction of different response patterns by differential receptor recruitment of type I interferons

Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Protei
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.
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For development medical drugs against different diseases a better understanding of the mechanisms of intracellular communication via cytokines is important. Cytokines are proteins synthesized and secreted by leukocytes w
For development medical drugs against different diseases a better understanding of the mechanisms of intracellular communication via cytokines is important. Cytokines are proteins synthesized and secreted by leukocytes which are particular relevant for stimulating the innate immune system. Here, type I interferons (IFN) elicit an antiviral, antiproliferative or immune modulatory response. In humans different IFN (several IFNa-subtypes, IFNb, IFNw, IFNe) are known which exert their activities via one shared receptor, comprised of the subunits ifnar1 and ifnar2. Strikingly, differential response patterns are elicited by different IFN. The objective of this project was to find a correlation between differential receptor recruitment of different IFN and the induction of differential response patterns. For studying the interactions purification of different IFN (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNw), mutants and cysteine mutants for selective fluorescence labelling in sufficient amounts and purity was established. For interaction analyses the extracellular domains of ifnar1 (ifnar1-EC) and ifnar2 (ifnar2-EC) were immobilized via decahistidine tags on different surfaces, which carried covalently attached chelator bis-NTA groups. The interaction was monitored in real time by reflectrometric interference spectroscopy (RIfS) and by total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS) in vitro. Here the stoichiometry, interaction kinetics and binding epitopes via competition to the receptor subunits was characterized. No differences were observed for stoichiometry (binary/ternary complex), binding epitopes or conformational changes of the receptor subunit ifnar1. Strikingly, for all IFNs significant differences in their binding affinities to ifnar1-EC and ifnar2-EC were observed. For the subunit ifnar2-EC a higher binding affinity was observed with differences up to three orders of magnitude compared to ifnar1-EC. The formation of the ternary complex was also studied. Furthermore the influence of receptor concentration on the stabilisation of the interferon binding in complex is examined. For examination differential cellular activities, the induction of the transcription factor ISGF3 (interferon stimulated gen factor 3), antiviral activity against vesicular stomatitis viruses (VSV) and antiproliferative activity were investigated. For ISGF3 activity strong differences between IFNs in the effective concentrations (EC50) were observed, which range from low pM to upper nM concentrations. For antiproliferative activity higher nM concentrations were necessary and a different response pattern compared to ISGF3 activity was observed. The binding affinities to ifnar2-EC and ifnar1-EC correlated with the different response patterns. Strikingly, the induction of ISGF3 activity is related to the binding affinity to ifnar2-EC. Here, the retention time of IFNs at low concentrations on the surface is increased by higher binding affinity to ifnar2-EC and so the possibility for complex assembling is increased. In contrast, the antiproliferative activity depends on the affinity to ifnar1. A striking correlation was observed for differential antiproliferative activity and the relative binding affinities towards ifnar1 and ifnar2. This was explained by differential modulation of the receptor concentration on the membran. By modulation the binding affinities the activity pattern was systematically changed, which confirms the correlation between affinity and activity.
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Metadaten
Author:Eva Jaks
URN:urn:nbn:de:hebis:30-30627
Referee:Jacob Piehler
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2006/08/03
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/06/19
Release Date:2006/08/03
Tag:affinities ; interferon receptor ; response patterns; type I interferon
SWD-Keyword:Aktivitätsmuster; Bindungsaffinität ; Interferonrezeptor ; Typ I Interferone
HeBIS PPN:180080652
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $