Structure of NhaA, a Na +/H + antiporter from Escherichia coli and insights into mechanism of action and regulation by pH

Sodium proton antiporters are ubiquitous membrane proteins found in the cytoplasmic and organelle membranes of cells of many different origins, including plants, animals and microorganisms. They are involved in cell ener
Sodium proton antiporters are ubiquitous membrane proteins found in the cytoplasmic and organelle membranes of cells of many different origins, including plants, animals and microorganisms. They are involved in cell energetics, and play primary roles in the homeostasis of intracellular pH, cellular Na+ content and cell volume. Adaptation to high salinity and/or extreme pH in plants and bacteria or in human heart muscles requires the action of such Na+/H+ antiporters. NhaA is the essential Na+/H+ antiporter for pH and Na+ homeostasis (at alkaline pH) in Escherichia coli and many other enterobacteria. NhaA is an electrogenic Na+/H+ antiporter that exchanges 2H+ for 1Na+ (or Li+). NhaA shares with many other prokaryotic and eukaryotic antiporters a very strong dependence on pH. In order to achieve three-dimensional structure of NhaA, the previously described NhaA protein preparation was modified: (i) the wild type bacterial strain (TA16) used for homologous over-expression of NhaA was replaced with a delta nhaA strain (RK20). As a result, the purity and homogeneity of the sample was significantly improved; (ii) the previously two-step purification procedure was shortened to a single step affinity chromatography purification; (iii) a wide-range screening of crystallisation conditions, more than 20,000, was performed; (iv) a Seleno-L-methionine (SeMet) NhaA derivative was produced in order to solve the phases during structure determination. In parallel, attempts of production and crystallisation of co-complexes composed of NhaA and antibody fragments have been made. Four different monoclonal antibodies were available against NhaA. Selected antibody fragments were produced and the stability of the complex analysed. Here, the crystal structure of the pH down-regulated secondary transporter NhaA of Escherichia coli is presented at 3.45 Å resolution. A negatively charged ion funnel opens to the cytoplasm and ends in the middle of the membrane at the putative ion-binding site. There, a unique assembly of two pairs of short helices connected by crossed, extended chains creates a balanced electrostatic environment. A possible mechanism is proposed: the binding of charged substrates causes electric imbalance inducing movements, which allow for a rapid alternating access mechanism. This ion exchange machinery is regulated by a conformational change elicited by a pH signal perceived at the cytoplasmic funnel entry. The structure represents a novel fold that provides two major insights: it reveals the structural basis for the mechanism of Na+/H+ exchange and its unique regulation by pH in NhaA and in many other similar antiporters. Furthermore, it is also important for the understanding of the architecture of membrane proteins in general. However, although many aspects of the ion-translocation mechanism and pH regulation are clarified by the NhaA structure, higher resolution structures with Li+ or Na+ bound are required for understanding the ligand binding and the translocation mechanism at the atomic level. The alkaline pH-induced conformation is essential to further understand the pH-control and proton access to the binding site.
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In der vorliegenden Dissertationsschrift wird die Röntgenstruktur des Na+/H+-Antiporters NhaA aus Escherichia coli vorgestellt, sowie ein Modell zum molekularen Mechanismus des pH-regulierten Kationen Transports entwicke
In der vorliegenden Dissertationsschrift wird die Röntgenstruktur des Na+/H+-Antiporters NhaA aus Escherichia coli vorgestellt, sowie ein Modell zum molekularen Mechanismus des pH-regulierten Kationen Transports entwickelt. Na+/H+-Antiporter sind ubiquitäre Membranproteine, die in der Plasmamembran oder in Organell-Membranen pflanzlicher, tierischer und bakterieller Zellen gefunden werden. Es sind sekundäre Transporter, die an der Energieumwandlung der Zelle beteiligt sind. Ausserdem regulieren sie die Homöostase des intrazellulären pH-Wertes, der zellulären Na+-Konzentration und des Zellvolumens (1). Bei chirurgischen Eingriffen am offenen Herzen, hat die Überaktivierung des humanen Antiporters NHE1 in Herzmuskelzellen gefährliche Konsequenzen. Diese werden verringert durch das Verabreichen Antiporter-inhibierender Präparate (2). In Pflanzen führt die Deletion der Gene, die für die vakuolären und zytoplasmatischen Na+/H+-Antiporter kodieren, zur Reduktion der Salztoleranz (3). Die Überexpression dieser Gene wird hingegen zur Produktion salzresistenter Pflanzen ausgenutzt (4). Viele prokaryotische Na+/H+-Antiporter ermöglichen dem entsprechenden Organismus Na+- Toleranz und/oder die Fähigkeit zum Wachstum bei alkalischem pH (5). Des weiteren stehen die Na+/H+-Antiporter unter dem Verdacht, an der Virulenz und/oder bei der Epidemiologie pathogener Enterobakterien beteiligt zu sein (6). Der Na+/H+-Antiporter NhaA aus E. coli wurde als Mitglied der CPA2 Gruppe innerhalb der Cation/Proton-Antiporter Superfamilie (CPA) klassifiziert. Diese Gruppe beinhaltet neben den prokaryotischen Vertretern neu identifizierte Homologe pflanzlicher und tierischer Herkunft, sowie die humanen Homologe HsNHA1 und HsNHA2 (7). NhaA ist ein elektrogener Antiporter mit der Stöchiometrie von 2H+/Na+ (Li+) (8). Die Antiporter NhaA und NhaB befinden sich in der Zytoplasmamembran von E. coli (9) und tauschen spezifisch Na+ oder Li+ gegen Protonen aus. Im Gegensatz dazu, akzeptiert ChaA, ein weiterer Antiporter aus E. coli, sowohl Na+ als auch Ca2+ als Substrat für den Austausch gegen Protonen (10). Von diesen Antiportern ist nur NhaA unverzichtbar für die Adaptation an hohe Salzkonzentrationen, für die Bewältigung der Li+ -Toxizität und für das Wachstum bei alkalischem pH-Wert (11). Die Aktivität des Antiporters NhaA ist stark vom pH-Wert abhängig. Zwischen pH 7 und pH 8 variiert die Transportrate um drei Größenordnungen, im sauren pH-Bereich ist der Antiporter vollständig abgeschaltet ...
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Metadaten
Author:Emanuela Screpanti
URN:urn:nbn:de:hebis:30-31698
Publisher:Univ.-Bibliothek
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:H. Michel, Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2006/09/28
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2005/10/25
Release Date:2006/09/28
Pagenumber:152
First Page:X
Last Page:130
Note:
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HeBIS PPN:350010412
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Weitere biologische Literatur (eingeschränkter Zugriff)
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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$Rev: 11761 $