Heterologous production, characterization and isolation of selected G protein-coupled receptors for structural studies

G protein-coupled receptors (GPCRs) play regulatory roles in many different physiological processes and they represent one of the most important class of drug targets. However, due to the lack of three-dimensional struct
G protein-coupled receptors (GPCRs) play regulatory roles in many different physiological processes and they represent one of the most important class of drug targets. However, due to the lack of three-dimensional structures, structure based drug design has not been possible. The major bottleneck in getting three-dimensional crystal structure of GPCRs is to obtain milligram quantities of pure, homogenous and stable protein. Therefore, during my Ph.D. thesis, I focused on expression, characterization and isolation of three GPCRs namely human bradykinin receptor subtype 2 (B2R), human angiotensin II receptor subtype 1 (AT1aR), and human neuromedin U receptor subtype 2 (NmU2R). These receptors were heterologously produced in three different expression systems (i.e. Pichia pastoris, insect cells and mammalian cells), biochemically characterized and subsequently solubilized and purified for structural studies The human bradykinin receptor subtype 2 (B2R) is constitutively expressed in a variety of cells, including endothelial cells, vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Activation of B2R is important in pathogenesis of inflammation, pain, tissue injury and cardioprotective mechanisms. During this study, recombinant B2R was produced in methylotrophic yeast Pichia pastoris (3.5 pmol/mg), insect cells (10 pmol/mg) and mammalian cells (60 pmol/mg). The recombinant receptor was characterized in terms of [3H] bradykinin binding, G protein coupling, localization, and glycosylation. Subsequently, it was solubilized and purified using affinity chromatography. Homogeneity and stability of purified B2R was monitored by gel filtration analysis. Milligram amounts of pure and stable receptor were obtained from BHK cells and Sf9 cells, which were used for three-dimensional crystallization attempts. The second receptor, which I worked on, is human angiotensin II receptor subtype 1 (AT1aR). AT1aR is distributed in smooth muscle cells, liver, kidney, heart, lung and testis. Activation of AT1aR is implicated in the regulation of blood pressure, hypertension and cardiovascular diseases. Recombinant AT1aR was produced at high levels in Pichia pastoris (167 pmol/mg), while at moderate levels in insect cells (29 pmol/mg) and mammalian cells (32 pmol/mg). The recombinant receptor was characterized in terms of [3H] angiotensin II binding, localization, and glycosylation. Subsequently, the receptor was solubilized and purified using affinity chromatography. Homogeneity and stability of purified AT1aR was monitored by gel filtration analysis. Milligram amounts of pure and stable receptor were obtained from Pichia pastoris, which were used for threedimensional crystallization attempts. In addition to B2R and AT1aR, I also attempted to produce and isolate the human neuromedin U receptor subtype 2 (NmU2R), which was deorphanized recently. It is found in highest abundance in the central nervous system, particularly the medulla oblongata, spinal cord and thalamus. The distribution of this receptor suggests its regulatory role in sensory transmission and modulation. During this study, recombinant NmU2R was produced in Pichia pastoris (6 pmol/mg) and BHK cells (9 pmol/mg). Recombinant receptor was characterized with regard to [125I] NmU binding, localization and glycosylation. Subsequently, the receptor was solubilized and purified using affinity chromatography. Due to its low expression level, further expression optimization is required in order to obtain milligram amounts for structural studies. The long-term goal of this study was to obtain three-dimensional crystal structure of recombinant GPCRs. However, 3-dimensional crystallization of human recombinant membrane proteins still remains a difficult task. On the other hand, recent advances in the solid-state NMR spectroscopy offer ample opportunities to study receptor-ligand systems, provided milligram quantities of purified receptor are available. Therefore, in parallel to 3-dimensional crystallization trials, purified B2R was also used for solid-state NMR analysis in order to investigate the receptor bound conformation of bradykinin. Preliminary results are promising and indicate significant structural changes in bradykinin upon binding to B2R. Further experiments are ongoing and will hopefully result in the structure of receptor bound bradykinin. One of the challenges in GPCR crystallization is the small hydrophilic surface area that is available to make crystal contacts. One possibility to overcome this problem can be the reconstitution of a GPCR complex with an interacting protein for cocrystallization. For this purpose, I coexpressed B2R and AT1aR, which form a stable heterodimer complex, in BHK cells. I could successfully isolate the heterodimer complex by using two-step affinity purification. Unfortunately, this complex was not stable over time and disassociates within three days of purification. However, during coexpression of B2R and AT1aR in BHK cells, I observed that B2R was localized in the plasma membrane in coexpressing cells while it was retained intracellularly when expressed alone. This coexpression of AT1aR with B2R resulted in a four-fold increase in [3H] bradykinin binding sites on the cell surface. In addition, these two receptors were cointernalized in response to their individual specific ligands. Interestingly, colocalization of B2R and AT1aR was also found in human foreskin fibroblasts (which endogenously express both receptors), in line with the possibility that heterodimerization may be required for surface localization of B2R in native tissues as well. This is the first report where surface localization of a peptide GPCR is triggered by a distantly related peptide GPCR. These data support the hypothesis that heterodimerization may be a prerequisite for cell surface localization of some GPCRs. A second approach that I followed to stabilize the purified B2R was to reconstitute the B2R-β-arrestin complex. β-arrestin is a cytosolic protein that participates in agonist mediated desensitization of GPCRs and therefore dampens the cellular responses initiated by the activation of GPCRs. I tried to reconstitute B2R-β-arrestin complex in vitro by mixing purified B2R and purified β-arrestin. But, no interaction of these two proteins was observed in the pull-down assays. However, a C-terminal mutant of B2R (where a part of the C-terminus of the B2R is exchanged with that of the vasopressin receptor) was found to interact with β-arrestin in vitro as revealed by pull-down assays. In conclusion, this work establishes the production, characterization and isolation of three recombinant human GPCRs. Recombinant receptors were produced in milligram amounts and therefore, pave the way for structural analysis. The heterodimer complex of B2R-AT1aR and B2R-β-arrestin complex can be of great help during crystallization. In addition, it was also found for the first time that the surface localization of a peptide GPCR can be triggered by heterodimerization with a distantly related peptide GPCR.
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Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Familie der Zelloberflächenrezeptoren dar. 1-5% des Wirbeltiergenoms kodiert für diese Rezeptorfamilie. Im Humangenom sind etwa 800-1000 Gene vertreten, die
Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Familie der Zelloberflächenrezeptoren dar. 1-5% des Wirbeltiergenoms kodiert für diese Rezeptorfamilie. Im Humangenom sind etwa 800-1000 Gene vertreten, die für GPCRs kodieren. Trotz der großen Unterschiede in ihrer Sequenz und Aktivierung haben alle GPCRs zwei Gemeinsamkeiten: (1) Ihre Architektur wird durch sieben Transmembranhelices beschrieben. (2) Ihre Funktion in der Signaltransduktion üben alle durch Aktivierung der heterotrimeren Guanylnukleotid-Bindeproteine (GProteine) aus. Die GPCRs sind an der Regulierung einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt und stellen daher wichtige Ziele für die Medikamentenentwicklung dar. Bisher gibt es kaum Möglichkeiten zur strukturbasierenden Medikamentenentwicklung, da, bis auf das Rinder-Rhodopsin, nur sehr wenige Informationen zur dreidimensionalen Struktur von GPCRs verfügbar sind. Das Rinder-Rhodopsin nimmt allerdings unter den GPCRs eine Sonderstellung ein. Im Gegensatz zu allen übrigen GPCRs bindet es seinen Liganden, 11-cis Retinal, kovalent und liegt dann in der nicht-aktivierten Form vor. Zudem kann Rhodopsin in großen Mengen aus Rinderretina isoliert werden, wohingegen die übrigen GPCRs nur in geringen Mengen in ihren natürlichen Geweben vorkommen. Die vorliegende Arbeit verfolgt drei Ziele: Erstens sollen GPCRs durch heterologe Expression in hohen Ausbeuten hergestellt und biochemisch charakterisiert werden. Die Etablierung eines Solubilisierungs- und Aufreinigungsprotokolls stellt das zweite Ziel dar. Drittens soll die Interaktion von Ligand und Rezeptor mittels verschiedener Techniken untersucht werden. Grund für die erste Zielsetzung ist die geringe Verfügbarkeit reinen, homogenen und stabilen Proteins im Milligramm-Maßstab, welches die größte Hürde für strukturelle Untersuchungen von GPCRs darstellt. Hier wurden verschiedene Expressionssysteme zur heterologen Produktion von Membranproteinen etabliert. Die Wahl des Expressionssystems ist hierbei entscheidend, um posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung sowie die korrekte Faltung des Rezeptors zu gewährleisten. Neben E. coli haben sich hierbei vor allem eukaryotische Expressionssystems wie Pichia pastoris bewährt. In der vorliegenden Arbeit wurden drei GPCRs hergestellt und analysiert: der humane Bradykinin Rezeptor Typ 2 (B2R), der humane Angiotensin II Rezeptor Typ 1 (AT1aR) und der humane Neuromedin U Rezeptor Typ 2 (NmU2R). Diese drei Rezeptoren wurden in drei Expressionsystemen (Pichia pastoris, Insektenzellen und Säugerzellen) heterolog produziert und biochemisch charakterisiert. Für jedes der drei Proteine wurden Solubilisierungs- und Aufreinigungsprotokolle etabliert. Die aufgereinigten Proteine wurden anschließend für Kristallisationsexperimente, für Festkörper NMR Untersuchungen und weitere Experimente eingesetzt. Der erste untersuchte Rezeptor, B2R, kann vor allem in Endothelzellen, vaskulären glatten Muskelzellen und Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Seine Aktivierung spielt bei der Entstehung von Entzündungen, Schmerz, Gewebsverletzung sowie herzschützenden Mechanismen eine Rolle. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde B2R in der Hefe Pichia pastoris (3,5 pmol/mg), in BHK-Zellen (10 pmol/mg) und in Sf9-Zellen (60 pmol/mg) erfolgreich rekombinant produziert. Zur Charakterisierung wurde die Bindung des Liganden [3H] Bradykinin, die GProtein- Kopplung, zelluläre Lokalisierung sowie die Glykosylierung des Rezeptors untersucht. Der heterolog produzierte Rezeptor konnte in hoher Reinheit isoliert werden. Homogenität und Stabilität des aufgereinigten Proteins wurden mittels Gelfiltration analysiert. Aus BHK und Sf9 Zellen konnten Milligramm-Mengen reinen und stabilen Rezeptors isoliert werden, die zu Kristallisationsexperimenten verwendet wurden. Hier zeigten sich kristallartige Strukturen, die zur Zeit weiter charakterisiert werden. Der zweite untersuchte Rezeptor, AT1aR, kann in glatten Muskelzellen, Leber, Nieren, Herz, Lunge und Hoden nachgewiesen werden. Die Aktivierung dieses Rezeptors spielt eine Rolle bei der Regulation des Blutdrucks und bei cardiovaskulären Erkrankungen. Rekombinanter AT1aR konnte mit hoher Ausbeute (167 pmol/mg) in Pichia pastoris hergestellt werden. Die Ausbeute bei Produktion in Insektenzellen (29 pmol/mg) und Säugerzellen (32 pmol/mg) lag im mittleren Bereich. Der rekombinante Rezeptor wurde hinsichtlich der Bindung von [3H] Angiotensin II, der zellulären Lokalisierung und Glykosylierung charakterisiert. Im Anschluss wurde er erfolgreich mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Homogenität und Stabilität des gereinigten AT1aR wurden mittels Gelfiltration analysiert. Aus Pichia pastoris konnte das Protein im Milligramm-Maßstab isoliert werden, so dass Kristallisationsexperimente möglich waren. Dem dritten Rezeptor, NmU2R, konnte erst kürzlich sein Ligand, Neuromedin U, zugeordnet werden. Der Rezeptor ist im zentralen Nervensystem, und hier insbesondere in der Medulla oblongata, dem Rückenmark und dem Thalamus lokalisiert. Aufgrund dieser Verteilung wird angenommen, dass er eine Rolle in der Regulation der Weiterleitung sensorischer Nervenimpulse sowie deren Modulation spielt. Während meiner Arbeit konnte ich bei der heterologen Produktion des Rezeptors Ausbeuten von 6 pmol/mg in Pichia pastoris und 9 pmol/mg in BHK Zellen erzielen. Der rekombinante Rezeptor wurde mittels Bindung eines Radioliganden ([125I] NmU) charakterisiert. Weiterhin wurde die zellulärer Lokalisierung und Glykosylierung des GPCRs untersucht. Obwohl der rekombinante NmU2R erfolgreich isoliert werden konnte, sind auf Grund der geringen Produktionsmengen zur Zeit keine Struktur untersuchungen möglich. Zur Analyse der pharmakologisch wichtigen Ligand-Rezeptor- Wechselwirkung wurde Festkörper NMR Spektroskopie eingesetzt. Durch die Verwendung von selektiv mit 13C und 15N markierten Peptiden können Konformationsänderung des Peptidliganden beim Binden des Rezeptors untersucht werden. Die Bestimmung der genauen Konformation des gebunden Liganden ist für die Medikamentenentwicklung von Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels der Festkörper NMR Spektroskopie die Konformation des rezeptorgebunden Liganden, Bradykinin, untersucht. Die ersten Ergebnisse weisen auf signifikante Strukturänderungen Bradykinins hin, sobald es an den B2R bindet. Untersuchungen bezüglich Wechselwirkung von GPCRs mit anderen Protein sind auch für die Kristallisation relevant. Eine der Herausforderungen in der Kristallisation von GPCRs ist die kleine hydrophile Oberfläche, die zur Bildung von Kristallkontakten im Kristallgitter oft nicht ausreichend ist. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu lösen, ist die Bildung eines stabilen Komplexes aus dem Rezeptor und einem interagierenden Protein. Zusätzlich kann der Rezeptor durch die Interaktion in eine weniger flexible Form überführt werden, was die Kristallisation und die spätere Strukturbestimmung erleichtern kann. Basierend auf diesem Ansatz wurden B2R und AT1aR, die einen stabilen heterodimeren Komplex bilden, in BHK Zellen ko-exprimiert. Bemerkenswert war hierbei dass B2R im Komplex mit AT1aR in der Plasmamembran vorzufinden war, während B2R alleine hauptsachlich in intrazellulären Membranen exprimiert wurde. Weiterhin führte die Koexpression der beiden Rezeptoren zu einem vierfachen Anstieg der [3H] Bradykinin Bindungsstellen auf der Zelloberfläche. Es konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass nach der Stimulation mit nur einem der beiden rezeptorspezifischen Liganden beide GPCRs zusammen internalisiert wurden. Dieses Phänomen wurde auch in menschlichen Vorhaut- fibroblasten nachgewiesen, in denen beide Rezeptoren vorkommen. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass auch in nativen Geweben die Anwesenheit des AT1aR für die Expression und den Transfer des B2R zur Plasmamembran nötig ist. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass Heterodimerisierung eine Voraussetzung für die Zelloberflächenlokalisierung bestimmter GPCRs ist. Der Ko-Komplex aus B2R und AT1aR konnte mittels dualer Affinitätschromatographie isoliert, wie durch SDS-PAGE Analyse, analytische Gelfiltration und Bindung von Radioliganden gezeigt werden konnte. „Pull-down“ Experimente, die drei Tage nach der Reinigung durchgeführt wurden, wiesen darauf hin, dass der Ko-Komplex nicht stabil war und zerfiel. Bei der Reinigung von Membranproteinen verursacht der Verlust von Lipiden während des Isolationsprozeßes oft eine Beeinträchtigung der Stabilität des Proteins. Auch das verwendete Detergenz beeinflusst die Stabilität von Membranproteinen. Experimente zur Verbesserung der Langzeitstabilität des Komplexes durch Zugabe von Lipiden und anderen Detergenzien sind in Vorbereitung. Die Bildung von Ko-Komplexen wurde zusätzlich mit Beta-Arrestin, einem Inhibitor der Kopplung von G-Proteinen und ihren Rezeptoren untersucht. Beta- Arrestin ist ein zytosolisches Protein, dass an der Desensibilisierung der Agoniststimulierten GPCRs beteiligt ist. Versuche, eine Ko-Komplexbildung aus gereinigtem B2R und gereinigtem Beta-Arrestin in vitro zu erzielen, schlugen fehl. In „Pull-Down“ Experimenten konnte keine Interaktion nachweisen werden. Wurde anstatt des nativen B2R eine C-terminale Mutante, bei welcher der C-Terminus des B2R gegen den des Vasopressinrezeptors ausgetauscht worden war, verwendet, konnte in vitro Ko- Komplexbildung mit Beta-Arrestin festgestellt werden. Mit Experimenten zur Bestimmung der Langzeitstabilität des Ko-Komplexes sowie zur Ko-Kristallisations wurde begonnen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Produktion, Charakterisierung und Aufreinigung von drei rekombinanten humanen GPCRs etabliert. Die rekombinanten Rezeptoren wurden im Milligramm-Maßstab produziert. Damit ist die erste, wesentliche Hürde zur Strukturanalyse genommen. Der B2R-β-Arrestin Komplex kann sich als vorteilhaft für die Kristallisation herausstellen. Zusätzlich konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass der Transfer eines GPCRs an die Zelloberfläche von der Heterodimerisierung mit einem anderen nicht-verwandten GPCR abhängig sein kann.
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Metadaten
Author:Arun Kumar Shukla
URN:urn:nbn:de:hebis:30-30165
Referee:Dieter Steinhilber
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2006/07/13
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/05/08
Release Date:2006/07/13
HeBIS PPN:179523147
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $