"A system for the intracellular generation of triple helix-forming oligonucleotides (TFOs) and the sequence-specific inhibition of human MCP-1 gene expression"

Etablierung eines Systems zur intrazellulären Generierung Triple-Helix-bildender Oligonukleotide und die sequenzspezifische Inhibition des humanen MCP-1

Chemokines play a key role in the cellular infiltration of inflamed tissue. They are released by a wide variety of cell types during the initial phase of host response to injury, allergens, antigens, or invading microorg
Chemokines play a key role in the cellular infiltration of inflamed tissue. They are released by a wide variety of cell types during the initial phase of host response to injury, allergens, antigens, or invading microorganisms, and selectively attract leukocytes to inflammatory foci, inducing both migration and activation. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), a member of the CC chemokine superfamily, functions in attracting monocytes, T lymphocytes, and basophils to sites of inflammation. MCP-1 is produced by monocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells and smooth muscle cells in response to various stimuli such as tumour necrosis factor-a (TNF-a), interferon-g (IFN-g), and interleukin-1b (IL-1b). It also plays an important role in the pathogenesis of chronic inflammation, and overexpression of MCP-1 has been implicated in diseases including glomerulonephritis and rheumatoid arthritis. Oligonucleotide-directed triple helix formation offers a means to target specific sequences in DNA and interfere with gene expression at the transcriptional level. Triple helix-forming oligonucleotides (TFOs) bind to homopurine/homopyrimidine sequences, forming a stable, sequence-specific complex with the duplex DNA. Purine-rich sequences are frequent in gene regulatory regions and TFOs directed to promoter sequences have been shown to prevent binding of transcription factors and inhibit transcription initiation and elongation. Exogenous TFOs that bind homopurine/ homopyrimidine DNA sequences and form triple-helices can be rationally designed, while the intracellular delivery of single-stranded RNA TFOs has not been studied in detail before. In this study, expression vectors were constructed which directed transcription of either a 19 nt triplex-forming pyrimidine CU-TFO sequence targeting the human MCP-1 or two different 19 nt GU- or CA-control sequences, respectively, together with the vector encoded hygromycin resistance mRNA as one fusion transcript. HEK 293 cells were stable transfected with these vectors and several TFO and control cell lines were generated. Functional relevant triplex formation of a TFO with a corresponding 19 bp GC-rich AP-1/SP-1 site of the human MCP-1 promoter was shown. Binding of synthetic 19 nt CUTFO to the MCP-1 promoter duplex was verified by triplex blotting at pH 6.7. Underlining binding specificity, control sequences, including the GU- and CA-sequence, a TFO containing one single mismatch and a MCP-1 promoter duplex containing two mismatches, did not participate in triplex formation. Establishing a magnetic capture technique with streptavidin microbeads it was verified that at pH 7.0 the 19 nt TFO embedded in a 1.1 kb fusion transcript binds to a plasmid encoded MCP-1 promoter target duplex three times stronger than the controls. Finally, cell culture experiments revealed 76 ± 10.2% inhibition of MCP-1 protein secretion in TNF-a stimulated CU-TFO harboring cell lines and up to 88% after TNF-a and IFN-g costimulation in comparison to controls. Expression of interleukin-8 (IL-8) as one TNF-a inducible control gene was not affected by CU-TFO, demonstrating both highly specific and effective chemokine gene repression. Furthermore, another chemokine target, regulated upon activation normal T cell expressed and secreted (RANTES), which plays an essential role in inflammation by recruiting T lymphocytes, macrophages and eosinophils to inflammatory sites, was analysed using the triplex approach. A 28 nt TFO was designed targeting the murine RANTES gene promoter, and gel mobility shift assays demonstrated that the phosphodiester TFO formed a sequencespecific triplex with the double-stranded target DNA with a Kd of 2.5 x 10-7 M. It was analysed whether RANTES expression could be inhibited at the transcriptional level testing the TFO in two different cell lines, T helper-1 lymphocytes and brain microvascular endothelial cells (bend3 cells). Although there was a sequence-specific binding of the TFO detectable in the gel shift assays, there was no inhibitory effect of the exogenously added and phosphorothioate stabilised TFO on endogenous RANTES gene expression visible. Additionally, the small interfering RNA (siRNA) approach was tested as another strategy to inhibit expression of the pro-inflammatory chemokines MCP-1 and RANTES. Two different methods were pursuit, describing transient transfection with vector derived and synthetic siRNA. The vector pSUPER containing the siRNA coding sequence was used to suppress endogenous MCP-1 in HEK 293 cells. An empty vector without RNA sequence served as a control. Inhibition due to the siRNA was measured in stimulated and unstimulated cells. In TNF-a stimulated cells MCP-1 protein synthesis was decreased by 35 ± 11% after siRNA transfection. Using a synthetic double-stranded siRNA, the TNF-a induced MCP-1 protein secretion could be successfully inhibited about 62.3 ± 10.3% in HEK 293 cells, indicating that the siRNA is functional in these cells to suppress chemokine expression. The siRNA approach targeting murine RANTES in Th1 cells and b-end3 cells revealed no inhibition of endogenous gene expression. Gene therapy approaches rely on efficient transfer of genes to the desired target cells. A wide variety of viral and nonviral vectors have been developed and evaluated for their efficiency of transduction, sustained expression of the transgene, and safety. Among them, lentiviruses have been widely used for gene therapy applications. In order to improve the delivery of TFOs or siRNAs into the target cells, cloning of the lentiviral transfer vector SEW, the production of lentiviral particles by transient transfection were performed with the aim to generate lentiviral vector-derived TFOs in further experiments. Here, Th1 cells were transduced with infectious lentiviral particles and transduction efficacy was measured. Transduction efficacy higher than 82% could be achieved using the lentiviral vector SEW, opening optimal possibilities for the TFO or siRNA approach.
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Die Chemokine sind eine Unterfamilie der Zytokine mit starker chemotaktischer Aktivität und übernehmen bei der Positionierung von Zellen im Organismus wichtige Aufgaben. Im Falle einer Infektion mobilisieren sie Effektor
Die Chemokine sind eine Unterfamilie der Zytokine mit starker chemotaktischer Aktivität und übernehmen bei der Positionierung von Zellen im Organismus wichtige Aufgaben. Im Falle einer Infektion mobilisieren sie Effektorzellen und leiten sie zu den Infektionsherden und ins lymphatische Gewebe. Darüber hinaus spielen Chemokine in der Organentwicklung, Wundheilung, Angiogenese, Angiostase, bei der homöostatischen Leukozytenrezirkulation und Immunregulation eine Rolle. MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) ist ein Mitglied der CC-Chemokin Familie und lockt eine Vielzahl von Zelltypen wie Monozyten, T-Lymphozyten und Basophile zum Entzündungsherd. MCP-1 wird von verschiedenen Zellen wie Monozyten, Fibroblasten, vaskulären Endothelzellen und glatten Muskelzellen nach Stimulation mit Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha) Interferon-gamma (IFN-gamma) oder Interleukin-1 beta (IL-1 beta) produziert. Eine Überexpression von MCP-1 wird in vielen entzündlichen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose und Glomerulonephritis gefunden. Ziel dieser Arbeit war es, molekulare Strategien auf dem Weg zu einer therapeutischen Anwendung zu entwickeln, um die Aktivität z.B. pro-inflammatorischer Chemokine wie MCP-1 und RANTES (regulated upon activation normal T cell expressed and secreted) zu modulieren. In der Literatur sind verschiedene erfolgreiche Prinzipien beschrieben, die auf dem Einsatz von kurzen Oligonukleotiden basieren, um die Expression spezifischer Gene zu hemmen. Hierzu gehören die Antisense-Oligonukleotide, triple helix-forming oligonucleotides (TFOs) und auch die small interfering RNA (siRNA). Im Unterschied zur Wirkung von siRNA und Antisense-Oligonukleotiden auf die mRNA Translation geht es in dieser Arbeit um das Design von therapeutischen Agenzien, die auf der DNA-Ebene durch sequenzspezifische Interaktionen die Transkription verändern können. In der Promoterregion des humanen MCP-1 Gens befindet sich eine geeignete TFO Zielsequenz in einer Länge von 19 bp. Diese Zielsequenz umfasst die Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren SP-1 und AP-1, welche sowohl bei der basalen als auch der induzierten Genexpression von MCP-1 eine entscheidende Rolle spielen. Generelle Schwierigkeiten der Oligonukleotid-Technologien wie der Einsatz hoher Konzentrationen, Notwendigkeit chemischer Modifikationen und die Transfektionseffizienz konnten durch die Etablierung von Vektoren zur intrazellulären Generierung von TFOs auf RNA-Basis maßgeblich verbessert werden. Verschiedene Kontrollen wurden in vitro durchgeführt, so auch der Nachweis der spezifischen Triplex-Formation mit synthetischen 19 nt Oligoribonukleotiden und dem 39 bp MCP-1 Promoterfragment. In Zelllinien, die konstitutiv TFOs generieren, konnte die endogene TNF-alpha induzierte MCP-1 Protein-Sekretion um 76 ± 10,2% im Vergleich zu Kontrollzelllinien inhibiert werden, die TNF-alpha induzierte IL-8 Expression blieb durch das TFO dagegen vollkommen unbeeinflusst. Auch in IFN-gamma stimulierten Zellen konnte eine Inhibition bis zu 83% erreicht werden, in TNF-alpha und IFN-gamma kostimulierten Zellen bis zu 88%. Die Präsenz der TFOs und der Kontrollen in den verschiedenen Zelllinien konnte über RT-PCR und Northern-Blots bestätigt werden. Ein weiteres Target war das murine RANTES, welches eine wichtige Rolle in der Chemoattraktion von Leukozyten während des Entzündungsprozesses spielt. Ein 28 nt TFO mit Purin-Bindungsmotiv (GT) wurde synthetisiert, und Triplex-Bildung mit der RANTES Promoterzielsequenz konnte im EMSA gezeigt werden. Für eine sequenzspezifische Triplex-Formation konnte ein Kd-Wert von 2.5 x 10-7 M bestimmt werden. Neben der TFO-Strategie wurde in dieser Arbeit auch die Möglichkeit von siRNAs untersucht, um die Expression des Chemokins MCP-1 zu inhibieren. Eine synthetische siRNA gegen MCP-1 erzielte in HEK 293 Zellen eine Inhibition der MCP-1 Protein-Sekretion von 62.3 ± 10.3%. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, den potentiellen Einsatz von TFO oder siRNA als gentherapeutisches Instrument durch geeignete Transfervektoren zu verbessern. In dieser Arbeit wurden lentivirale Partikel durch eine transiente Transfektion von 239T Zellen mit dem Transfervektor SEW und den notwendigen Verpackungsvektoren hergestellt. Der SEW Vektor enthält als Marker das grüne Fluoreszenzprotein (GFP). Im Anschluss wurden Th1 Zellen mit den infektiösen lentiviralen Vektoren transduziert. Die relative Frequenz an GFP-produzierenden Zellen konnte mittels FACS-Analyse bestimmt werden. Die Transduktionseffizienz lag bei 82%. Durch diese hohe Transduktionseffizienz ergeben sich auch optimale Bedingungen für den Einsatz von TFO und siRNA. Die erfolgreichen TFO- und siRNA-Sequenzen gegen das humane MCP-1 könnten weiterhin auch lentiviral exprimiert werden, um den Gentransfer zu verbessern. Die Effizienz der beiden Strategien könnte in verschiedenen Zelllinien und letztendlich auch im Tiermodell überprüft werden.
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Metadaten
Author:Kordula Kautz
URN:urn:nbn:de:hebis:30-24684
Referee:Dieter Steinhilber
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2006/03/31
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/02/17
Release Date:2006/03/31
SWD-Keyword:Chemokine ; Gentherapie
HeBIS PPN:176785914
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $