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Carsten Mim

• In dieser Arbeit wurden die neuronalen Glutamattransporter EAAT4 (Excitatory Amino Acid Transporter) und EAAT3 in einem HEK (Human Embryonic Kidney) Zellsystem untersucht, in dem die Transporter transient exprimiert wurden. Diese Proteine katalysieren den Transport von Glutamat entgegen des Konzentrationsgradienten aus dem Extrazellulärraum in das Zytosol. Die Energie des Transports, stammt aus dem Kotransport von Natriumionen und Protonen und dem Gegentransport von Kaliumionen. Für EAAT3 ist bekannt, dass das Verhältnis 3 Na+:1 H+:1 Glutamat:1 K+ beträgt, wodurch 2 positive Ladungen pro Transportzyklus verschoben werden. Das führt zu einem messbaren positiven Einwärtststrom. Dieser Strom ist für EAAT4 wesentlich schwächer und die Stöchiometrie ist unbekannt. Beide Proteine besitzen eine Anionenkanaleigenschaft, die bei der Bindung von Na+ und der Bindung von Glutamat voll aktiviert wird. Diese Eigenschaft ist bei EAAT4 besonders ausgeprägt. Die Transporter wurden in Abhängigkeit von verschiedenen intra- und extrazellulären Ionen- und Substratkompositionen, sowie bestimmter Potentialen und der Temperatur elektrophysiologisch charakterisiert. Die Charakterisierung der stationären Eigenschaften des wenig bekannten Transporters EAAT4 brachten Erkenntnisse zu Tage, die 1) Klarheit über die apparenteAffinitäten der Substrate, insbesondere Glutamat und Na+ bringen 2) neu in Bezug auf die Spannungsabhängigkeit der apparenten Affinität von Glutamat sind. Die Untersuchung der vorstationären Ableitungen waren fruchtbar in Bezug auf a) die Ähnlichkeit des Transports, der durch EAAT4 katalysiert wird, zu anderen Glutamattransporter b) spezifische Parameter des Transports, wie den Unterschied in der Transportgeschwindigkeit c) die neuartige Kinetik der Anionenleitfähigkeit. Aus den Daten ergibt sich folgendes Bild über den Mechanismus des Transports. Die Substrate binden an EAAT4, im Vergleich zu den anderen Transportern, mit wesentlich höheren Km [ (0,6 ± 0,1)µM für Glutamat und (42,3 ± 5,2)mM für Na+]. Die Bindung von Glutamat, die schnell verläuft, ist, wie bei EAAT3, stark Na+ abhängig, genau wie die Leckleitfähigkeit, die ebenfalls durch Na+ aktiviert wird. Die folgenden glutamatabhängigen, vorstationären Reaktionen, inklusive der Translokation der Substrate verläuft wesentlich langsamer, als in anderen Transportersubtypen. Die Folge ist eine geringe Umsatzrate (<3 1/s) und daher ein geringer Transportstrom [(-3,6 ± 2,8)pA]. Die Daten zeigen, dass EAAT4 trotzallem denselben prinzipiellen Mechanismus, wie die anderen Subtypen folgt. Das Verhalten der Anionenleitfähigkeit zeigt allerdings erhebliche Unterschiede zu anderen Subtypen, da die Anionenleitfähigkeit durch negative Membranpotentiale inhibiert wird. Dies wird durch die Inhibierung der K+-Relokationsreaktion des Transporters erklärt. Zusammengenommen spricht die geringe Umsatzrate und die hohe apparente Affinität für Glutamat dafür, dass EAAT4 ein hochspezialisierter Transporter für die schnelle Pufferung von Glutamat und den langfristigen Transport von Glutamat bei niedrigen Konzentrationen ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Temperaturabhängigkeit des Glutamattransports durch EAAT3 untersucht. Die Temperaturabhängigkeit des Transports unter stationären Bedingungen zeigte interessante neue Ergebnisse. Die Ergebnisse lassen Aussagen zu bezüglich 1) der Thermodynamik der Bindung der Substrate und 2) der molekularen Natur bestimmter Teilreaktionen im Zyklus Die Bindung eines nicht-transportierbaren Glutamatanalogons zeigt, dass die Inhibitorbindung exotherm ist (H = 30,0 ± 3,3)kJ/mol. Die Bindung von Na+ an den unbeladenen Transporter ist im Gegensatz dazu nicht signifikant von der Temperatur abhängig mit H = (20,8 ± 21,5)kJ/mol. Es ist ebenfalls interessant, dass die Freie Enthalpie des Gesamtzyklus beiEAAT4 signifikant grösser ist als bei EAAT3, was in Übereinstimmung mit der höheren, apparenten Glutamataffinität ist [GEAAT4 = (35 ± 1)kJ/mol vs. .GEAAT3 = (30 ±1)kJ/mol]. Die Temperaturabhängigkeit der vorstationären Kinetik von EAAT3 enthüllt gleichfalls neue Ergebnisse. Zum einen ist die Bindung des Na+ Ions and den unbeladenen Transporter mit einer Konformationsänderung begleitet. Im Gegensatz dazu hat die Reaktion, die der Glutamatbindung zugeordnet wurde, nur eine moderate Aktivierungsenthalpie [H‡ = (39 ± 23 )kJ/mol], wie für eine diffusionskontrollierte Reaktion erwartet wird. Die nachfolgenden zwei langsameren Phasen des Transportstroms, die in der Literatur der Aktivierung der Anionenleitfähigkeit und der Glutamattranslokation zugeordnet wurden, sind mit hohen Aktivierungsenthalpien verbunden [H‡ = (121 ± 12)kJ/mol bzw. (94 ± 4)kJ/mol]. Dies bedeutet zum einen, dass zur Öffnung des Anionenkanals und der Translokation von Glutamat eine grössere Umstrukturierung des Transporters notwendig ist. Durch die hier gefundenen, neuen Daten für die Translokationsgeschwindigkeit bei physiologischen Temperaturen kann die Hypothese in Frage gestellt werden, die besagt, dass Glutamattransporter nicht schnell genug seien, um zur schnellen Entfernung des Glutamats nach der synaptischen Transmission beizutragen. Es scheint vielmehr so, dass bei physiologischen Temperaturen und Membranpotentialen, die Translokation von Glutamat hinreichend schnell verläuft.
• In this work I investigated the neuronal glutamate transporters EAAT3 and EAAT4 in an Human Embryonic Kidney cell line, where they have been transfected transiently. These proteins catalyse the transport of glutamate from the extracellular space into the cytosol. The energy for this comes from the cotransport from sodium ions and protons and the antiport of potassium ions. For EAAT3 it is known that the transport ratio is 3 Na+:1 H+:1 glutamate:1 K+. That means that 2 positive charges are tranferred over the membrane which generates a measurable inward current. This current is rather weak in EAAT4 and the stoichometry in this protein is unknown too. EAAT3 as well as EAAT4 comprise an anion conductivity which is fully activated when glutamate and Na+ is bound to the protein. This property is is prominent in EAAT4. The transporter have been characterised by varying intra- and extracellular ion and substrate composition and by means of electrophysiological techniques. The influence of membrane potential and temperature was investigated as well. The characterisation of the stationary properties of the transporter EAAT4 gave new insights of 1) the apparent affinity of the substrates, in particular glutamate and Na+ 2) the voltage dependency of the apparent affinity for glutamate. The presteady state recordings helped to answer questions with regard to a) the transport mechanism of EAAT4 b) specific transport parameters like differences of the transport rate or c) the novel kinetic of the anion conductance. The substrates that bind to EAAT4 have higher Km compared to other subtypes [ (0.6 ± 0.1)µM for glutamate and (42.3 ± 5.2)mM for Na+]. Like EAAT3 binding of glutamate and activation of the anion conductance is Na+ dependent in EAAT4. The following glutamate dependent, prestationary reactions, including the glutamate translocation, are slow compared to other subtypes. This results in a slow turnover rate (<3 1/s) and thus a slow transport current. The results show that transport in EAAT4 follows the same principles like any other subtypes. The behavior of the anion conductance shows significant differences. This conductance is inhibited by negative membrane potentials. The inhibition is caused by the K+ relocation reaction within the transport cycle. The low turnover rate and the high aparent affinity for glutamate identifies EAAT4 as a highly specialised transporter that buffers and binds glutamate effectively and keeps the glutamate concentrations low in the extracellular space. In the second part of my work I investigated the temperature dependence of glutamate transport in EAAT3. The results allow conclusions on 1) the thermodynamics of the substrate binding reactions 2) and the molecular nature of particular partial reactions. The binding of a non-transportable glutamate analogue shows that the binding reation is exothermic [(H = 30.0 ± 3.3)kJ/mol]. By contrast binding of Na+ to the empty transporter does not significantly change with temperature [H = (20.8 ± 21.5)kJ/mol]. Further it is interesting that the Free Enthalpy of the whole cyle of EAAT4 is significantly bigger than in EAAT3, which is in line with the higher aparent glutamate affinity [GEAAT4 = (35 ± 1)kJ/mol vs. GEAAT3 = (30 ±1)kJ/mol]. The temperature dependence of the prestationary kinetics for EAAT3 reveals novel properties. First the binding of Na+ to the empty transporter is accompanied with a moderate conformational change. Whereas glutamate binding is accompanied with a low activation enthalpy [H‡ = (39 ± 23 )kJ/mol], which is specific for a diffusion controlled reaction. The subsequent two slower phases of the transport current, assigned to the activation of the anion conductance and glutamate translocation respective, are related to an high actiavtion enthalpy [H‡ = (121 ± 12)kJ/mol vs (94 ± 4)kJ/mol resp.]. This means that the opening of the anion channel and the translocation of glutamate is accompanied with a larger reorganisation of the transporter. The experimental data for the translocation rate challenge the hypothesis that glutamate transporters are to slow to contribute significantly to the removal of glutamate after the synaptic transmission. It seems that the translocation is at physiological temperatures and potentials fast enough to perform this function.