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Irena Ivanova

• The endocannabinoids (EC), their synthetizing and metabolizing enzymes, and the cannabinoid (CB) receptors comprise the endocannabinoid system (ECS) that has been detected by Yasuo et al. (2010) in rodent and human brain areas essential for circadian rhythmic control and hormone secretion. The EC are secreted in the pars tuberalis formation (PT) of the pituitary gland and unfold their effect as ligands on cannabinoid receptors type 1 (CB1) in the pars distalis (PD). The CB1 is mostly expressed on folliculo-stellate (fs) cells of the PD. The fs cells execute regulative and supportive functions to adjacent hormone-producing cells (Allaerts and Venkelecom, 2005; Mitsuishi et al., 2013). The lipid and calcium binding protein Annexin A1 (Anx A1) and the cell membrane permeable compound nitric oxide (NO) have been detected in the fs cells (Woods et al., 1990; Devnath and Inoue, 2008). There are published findings indicating strong influence of Anx A1 and NO on hormone production (Taylor et al. 1993; Venkelecom et al, 1997). The hypothesis of this study is that the EC influence hormonal secretion by acting upon CB1 receptors on fs cells and thus activating or inhibiting Anx A1 and NO that directly affect adjacent glandular cells. Prevalently cell models were used to carry out the experimental work. The TtT/GF and Tpit/F1 cell lines represent the fs cells, the AtT20/D16v stand for the ACTH-producing corticotroph (C) cells, and GH4C1 for the PRL-producing lactotroph (L) cells. Whenever comparison with an integrity model was possible tissue from C3H mice was used. Chemoluminescent and photometrical detection, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence-activated cell sorting (FACS), immunoblot (IB), immunocyto- and immunohisto-chemical analysis (ICC, IHC), in situ hybridization (ISH), and (q) PCR methods were used as assaying tools to investigate CB1, Anx A1, the Anx A1 receptor - Fpr-rs1, NO, ACTH, and PRL. CB1 was detected on the fs, C, and L cell models. The presence of fatty acid amide hydrolase (FAAH, an EC degrading enzyme) was confirmed in the fs cells. Incubations of the fs cells with CB1 agonists (2-AG, AEA, WIN) and antagonist (otenabant) were performed and resulting increase of Anx A1, and inhibition of NO were detected. Anx A1 binding sites, known as formyl peptide like receptor – related sequence 1 (Fpr-rs1) were identified on the C and L cells. The hormone-producing cells were treated with a 2-AG, Anx A1, and NO and the resulting changes in the levels of ACTH and PRL were detected. Anx A1 acted stimulatory on ACTH in the C AtT20/D16v cell and inhibitory on PRL in the L GH4C1 cell. NO inhibited both ACTH and PRL release. Additional analysis of the levels of expression of mRNA for Anx A1 and Fpr-rs1 in murine PD tissue demonstrated that while the expression of the first was not influenced by time, the expression of the latter was activated during the subjective day. The here presented study shows that EC influence the ACTH release stimulatory through activating Anx A1 and inhibiting NO. As for PRL, the EC unfold an inhibition through activating Anx A1, and stimulation through inhibiting NO. A clear regulatory linkeage between the EC and ACTH and PRL control is revealed, involving the fs cells with possible time-dependence.
• Die Hypophyse, die vom Hypothalamus gesteuert wird, hat als Hauptfunktion die Regulation der hormonellen Produktion im Körper. Die corticotrophen (C) und lactotrophen (L) Zellen, die sich in der Pars distalis (PD) der Hypophyse befinden, produzieren entsprechend Adrenokortikotropin (ACTH) und Prolaktin (PRL). Die Endocannabinoide (EC) sind für ihre Wirkung auf die Freisetzung von ACTH und PRL bekannt. Die EC führen bei der Ratte zu erhöhten ACTH-Spiegeln (Weidenfeld et al., 1994) und zu niedrigeren PRL-Spiegeln (Scorticati et al., 2003). Die EC und die Fettsäurenamidhydrolase (FAAH), ein EC-abbauendes Enzym, sind Bestandteile des sogennanten Endocannabinoid Systems (ECS), das Areale im Hypothalamus und in der Hypophyse umfasst. Die EC in der Hypophyse werden überwiegend in der Pars tuberalis (PT) gebildet. Die Annahme, dass EC auf die C und L Zellen der PD wirken, ist durch das Vorhandensein von Cannabinoid Rezeptoren Typ 1 (CB1) belegt (Yasuo et al., 2010). Die follikulo-stellären (fs) Zellen, die sich in unmittelbarer Nähe zu den corticotrophen und lactotrophen Zellen befinden, stellen eine interessante Zellpopulation dar, deren Funktion sehr vielseitig und noch nicht vollständig geklärt ist (Allaerts and Vankelecom, 2005; Mitsuishi et al., 2013). Meine Annahme ist, dass die fs Zellen mit dem ECS auf einer Seite und mit den C und L Zellen auf anderer Seite interagieren. Yasuo und Korf (2011) haben gezeigt, dass die EC die Kommunikation zwischen der PT und der PD vermitteln. Die EC werden durch NAPE-PLD und DAGL in der PT synthetisiert und durch FAAH und MAGL in der PD abgebaut. Der Nachweis der dazugehörigen CB1 Rezeptoren in der PD (und nicht in der PT) unterstützt die veröffentlichten Aussagen. Yasuo et al. (2010) konnten belegen, dass die Spiegel von DAGL und 2-AG in der PT und von PRL im Plasma von Hamstern, die unter „Sommer“- Bedingungen gehalten wurden, erhöht waren. Die Hypothese meiner Arbeit war ursprünglich, dass die EC zu einer Aktivierung der Produktion und Freisetzung von ACTH und PRL führen, die über die fs Zellen vermittelt wird. Es ist in der Literatur bekannt, dass die fs Zellen das Protein Annexin A1 (Anx A1) und das anorganische Molekül Stickstoffmonoxid (NO) bilden (Traverso et al., 1999; Devnath and Inoue, 2008). Ihre Funktion als Botenstoffe wurde untersucht. Es wurde angenommen, dass die EC die Ausschüttung von Anx A1 und NO hemmen, die ihrerseits hemmend auf die ACTH und PRL Synthese in den corticotrophen und lactotrophen Zellen der PD wirken, sodass diese gehemmte Hemmung (Disinhibition) zu einer vermehrten Freisetzung von ACTH und PRL führt. Der Nachweis des CB1 Rezeptors auf den hier verwendeten fs Zellmodellen (TtT/GF und Tpit/F1) war ein erstes essentielles Experiment. Auch musste experimentell geklärt werden, ob die untersuchten fs Zellen Anx A1 und NO produzieren. Daher wurden Nachweismethoden für Anx A1 und NO entwickelt und etabliert. Als nächstes sollten Stimulationen mit CB1-Ago- und Antagonisten durchgeführt und Konzentrationen von Anx A1 und NO bestimmt werden. Weiterhin sollte geprüft werden, ob ein Rezeptor für Anx A1 an den C und L Zellen exprimiert wird. Hierzu musste eine Nachweismethode für den Anx A1 Rezeptor entwickelt werden, da es zur Zeit der Untersuchung keine passenden Antikörper auf dem Markt gab. Anschließend wurden Stimulationen mit EC, Anx A1 und NO bei den C und L Zellen durchgeführt und die Spiegel von ACTH und PRL bestimmt. Immunocytochemie (ICC) mit DAB oder Fluoreszenz als Markierung wurde zunächst zum Nachweis des CB1 Rezeptors verwendet. Die Ergebnisse wurden durch das Immunoblot Verfahren (IB; Western Blot) bestätigt. Anx A1 wurde mittels Immunohistochemie (IHC), IB, Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), in situ Hybridisierung (ISH) und Polymerase Ketten-Reaktion (PCR) bestimmt. NO wurde durch die Griess Reaktion photometrisch und durch eine Ozon-Reaktion chemilumineszent bestimmt. Weiterhin erlaubte die Reaktion mit dem Fluorofor DAF-2AC eine direkte Detektion und Beobachtung der NO-positiven Zellen, sowohl an den immortalisierten Zelllinien, als auch am Gewebe mit konfokaler Mikroskopie. Weiterhin konnten DAF-2AC-markierte Zellen mit der FACS Methode selektiert und analysiert werden.