Open Access

Theresa Geis

• Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignant tumor and third leading cause of cancer-related death worldwide. Most cases arise as a consequence of underlying liver disease, e.g. developed from chronic hepatitis B or C infectionsalcohol abuse or obesity, and are most often associated with liver cirrhosis. Hypoxiand the hypoxia inducible factors (HIF)-1α and -2α promote tumor progression of HCC, not only affecting tumor cell proliferation and invasion, but also angiogenesis and lymphangiogenesis and thus, increasing the risk of metastasis. HCC is characterized as one of the most vascularized solid tumors. While HIF-1α and HIF-2α are frequently up-regulated in HCC only HIF-2α is correlated with high patientlethality. HIF-dependent regulation of HCC angiogenesis is controversially discussed.VEGFA, for example, as the most prominent factor inducing tumor angiogenesis represents not only a HIF-1 target, but also a HIF-2 target gene in HCC. This questions whether both isoforms have overlapping functions in regulating the angiogenic switch in HCC. Besides angiogenesis also tumor-associated lymphangiogenesis significantly influences patient survival in HCC. Lymphatic spread is an important clinical determinant for the prognosis of HCC, but little is known how lymphangiogenesis is controlled in this context. To date, mainly HIF-1α was positively correlated with olymphatic invasion and metastasis in HCC, while a defined role of HIF-2α is missing. Thus, although HIF-1α and HIF-2α are structurally alike and regulate overlapping but not identical sets of target genes, they promote highly divergent outcomes in cancer progression and may even have counteracting roles. The aim of my work was to characterize the specific role of HIF-1α and HIF-2α in the angiogenic switch and lymphangiogenesis induction during HCC development. Therefore, I created a stable knockdown of HIF-1α and HIF-2α in HepG2 cells and generated cocultures of HepG2 spheroids and embryonic bodies derived from embryonic mouse stem cells as an in vitro tumor model mimicking the cancer microenvironment to analyze which HIF isoform has key regulatory functions in HCC (lymph)angiogenesis. In cocultures with a HIF-2α knockdown angiogenesis was attenuated but lymphangiogenesis increased, while the knockdown of HIF-1α was without effect. Microarray analysis identified plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)and insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1) as HIF-2 target genes.However, prominent angiogenic and lymphangiogenic factors such as VEGFs, PDGFB, ANG and their receptors were not regulated in a HIF-dependent manner. As PAI-1 was linked to angiogenesis in literature and IGF-signaling, which is negatively regulated by IGFBP-1, was correlated with lymphangiogenesis, I decided to investigate their HIF-2α-dependent influence on HCC (lymph)angiogenesis. The knockdown of PAI-1 in HepG2 cells also lowered angiogenesis in PAI-1k/d cocultures similar to the HIF-2α k/d phenotype. PAI-1 as the potent inhibitor of tPA and uPA, both inducing the conversion of plasminogen to plasmin, also inhibits plasmin directly. Therefore, I assumed an increase of plasmin in HIF-2α k/d and PAI-1 k/d cocultures as a result of the reduced PAI-1 levels. Blocking plasmin with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored angioge nesis, suggesting that HIF-2α increases PAI-1 to lower concentrations of active plasmin, thereby supporting angiogenesis. In further experiments I could exclude PAI-1 to reduce angiogenesis by inducing plasmin-mediated apoptosis of differentiating stem cells in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, but demonstrated an increase of VEGFA165 degradation in these cocultures, suggesting plasmin-catalyzed proteolysis of VEGF as an additional layer of regulation required to explain the angiogenic phenotype. Besides the pivotal role of PAI-1 in angiogenesis I also investigated its potentialinfluence in lymphangiogenesis. Indeed, the knockdown of PAI-1 reduced lymphaticstructures and implied an important but opposing role in lymphangiogenesis comparedto induced lymphangiogenesis in HIF-2α k/d cocultures. However, blocking plasmin again with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored lymphangiogenesis to the level of control virus, which indicates a divergent lymphangiogenic role of plasmin in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, possibly because of other essential pathways masking the lymphangiogenic effects of PAI-1 in HIF-2α k/d cocultures. HIF-2α resulting in reduced IGFBP1 expression induced the differentiation of stem cells toward a lymphatic cell type and significantly enhanced the assembly of human dermal lymphatic endothelial cells into tubes. These data point the first time to an important impact of HIF-2 in the regulatin of lymphangiogenesis in vitro by inducing IGFBP1 and thus, scavenging IGF-1. Furthermore, matrigel plug assays to investigate the in vivorelevance of these observations confirmed HIF-2α as a crucial factor in the regulation of lymphangiogenesis in vivo In conclusion, this work provides evidence that HIF-2α is a key regulator of angiogenesis and lymphangiogenesis in HCC by regulating PAI-1 and IGFBP1. HIF-2α positively influences the angiogenic switch via PAI-1 and negatively affects lymphangiogenesis via IGFBP1 expression. Targeting HIF-2α in HCC to reduce tumor angiogenesis should be approached carefully, as it might be overcome by induced lymphangiogenesis and metastasis.
• Das Hepatozelluläre Karzinom (Hepatocellular Carcinoma, HCC) stellt die weltweit fünfthäufigste Krebserkrankung und die dritthäufigste tumorbedingte Todesursache dar. In Deutschland treten rund 8400 neue Erkrankungsfälle pro Jahr auf (etwa 6000 Männer, 2400 Frauen), meist aufgrund von Hepatitis C-Infektionen, Alkohol-Missbrauch oder der zunehmende Fettleibigkeit sowie Typ2-Diabetes mellitus. Hepatozelluläre Karzinome führen meist erst spät zu Symptomen, wodurch bei der Mehrzahl von Patienten eine ungünstige Prognose vorliegt. Nur 40% der Patienten sind daher für Krebstherapien geeignet, wobei die operative Teilentfernung der Leber und Lebertransplantation zu den erfolgsversprechendsten Therapien gehören, jedoch ausschließlich bei Patienten mit nicht-metastasierten Tumoren. Die Entdeckung und Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten ist daher von großer Bedeutung.HCC zählt zu den am stärksten vaskularisierten Tumoren. Die sekundäre Angiogenese in Tumoren wird aufgrund der geringeren Sauerstoffversorgung (Hypoxie) des schnell proliferierenden Tumors eingeleitet. Das initiale Ereignis dabei ist der „angiogenic switch”, der das Gleichgewicht von Angiogenese-Inhibitoren in Richtung Angiogeneseinduzierenden Faktoren verschiebt. Er ist die Vorrausetzung für die Entwicklung eines prämalignen Zustands zu einem invasiven Tumor. Die sich daraufhin ausbildenden Blutbahnen können den Tumor mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgen, zeigen jedoch strukturelle und funktionelle Anormalitäten. So bieten sie eine große Oberfläche ungeordneter und durchlässiger Gefäße, die den Eintritt von Tumorzellen ins Gefäßinnere und eine Metastasierung in entfernt liegende Organe begünstigen. Zusätzlich gewährleisten diese Anormalitäten auch das weitere Bestehen von hypoxischen Bereichen, die chemoresistenter sind und somit den therapeutischen Erfolg drastisch reduzieren. Bei der Regulation dieser Prozesse spielen Hypoxie-Induzierbare Faktoren (HIFs) eine entscheidende Rolle. HIFs regulieren als Schlüsselfaktoren die adaptiven molekularen Antworten der Zelle auf eine mangelnde Sauerstoffversorgung. Diese Transkriptionsfaktoren bestehen aus einer Sauerstoff-labilen α-Untereinheit (HIF-1α; HIF-2α, genetisch codiert als EPAS1; HIF-3α) und einer konstitutiv exprimierten und stabilen β-Untereinheit (HIF-1β oder ARNT). Bei normaler Sauerstoffversorgung (Normoxie) wird die α-Untereinheit durch spezifische Prolylhydroxylasen an zwei konservierten Prolinresten hydroxyliert und dadurch für den proteosomalen Abbau markiert. Unter Hypoxie ist diese Hydroxylierung gehemmt und die HIF-α-Untereinheit stabilisiert. Die HIF-α-Untereinheiten dimerisieren daraufhin mit HIF-1β und binden an spezifischen Bindestellen (hypoxia response elements, HREs) in den Promotor-Bereichen ihrer Zielgene, wodurch sie deren Expression induzieren. Einige Arbeiten in der Literatur zeigten, dass hierzu auch der bekannteste Angiogenese induzierende Faktor vascular endothelial growth factor A (VEGFA) gehört, der in HCC sowohl von HIF-1 als auch von HIF-2 reguliert sein soll. Dies wirft die Frage auf, ob beide HIFIsoformen überlappende Funktionen in der Regulation des „angiogenic switch“ in HCC besitzen oder doch nur einer der beiden Faktoren für diesen Prozess entscheidend ist. Neben der Tumor-Angiogenese stellt auch die tumor-assoziierte Lymphangiogenese einen entscheidenden diagnostischen Parameter in HCC dar und korreliert mit einer schlechten Patientenprognose. Allerdings sind die dabei grundlegenden Mechanismen zur Entstehung tumor-induzierter Lymphgefäße in hepatozellulären Karzinomen noch wenig bekannt. Bisherige Studien postulierten eine entscheidende Rolle von HIF-1 als Stimulus für ymphangiogenese in HCC durch Induktion der Faktoren VEGFA/-C/-D und korrelierten HIF-1α mit Invasion und Metastasierung. Ziel meiner Arbeit war es deshalb, die funktionelle Rolle von HIF-1α und HIF-2α im "angiogenic switch“ und der Induktion der Lymphangiogenese während derTumorgenese des hepatozellulären Karzinoms zu bestimmen. Hierfür verwendete ich ein 3-dimensionales Kokultur-Modell aus HepG2-Tumorsphäroiden und Stammzellsphäroiden aus embryonalen, pluripotenten Mausstammzellen (embryonic bodies, EB). Die Kokultivierung beeinflusst die Differenzierung der Stammzellen entsprechend der vom Tumor ausgesendeten Stimuli zu einer Vielzahl von Zelltypen unter anderem zu CD31-positiven vaskulären Endothelzellen, aber auch zu VEGFR3-positiven lymphatischen Endothelzellen. Der Vorteil dieses Modells ist, dass es der Situation eines Tumors in vivo ähnelt, indem es das umgebende Gewebe imOrganismus nachahmt und sich sowohl ein Sauerstoff- als auch ein Nährstoffgradientin der Kokultur entwickelt. Dies ermöglicht die Untersuchung von HIF-abhängigen Antworten innerhalb des „angiogenic switch“ und der Lymphangiogenese außerhalb eines Tiermodells. Zunächst reduzierte ich die Expression von HIF-1α und HIF-2α durch lentivirale Transduktion von HepG2 Zellen mit short hairpin (sh)RNA. Durch die Kokultivierung der HIF-1α knockdown (k/d), HIF-2α k/d als auch Doppel-knockdown (dkd, gleichzeitiger knockdown beider HIF-Isoformen) Tumorsphäroide mit EBs konnte ich nachweisen, dass HIF-2α die Angiogenese in HCC positiv reguliert, da die reduzierte HIF-2α Expression die Induktion der Angiogenese signifikant reduzierte. Des Weiteren zeigte sich ebenfalls eine Bedeutung von HIF-2α als negativer Regulationsfaktor in der Lymphangiogenese, nachdem ein HIF-2α k/d zu einer signifikanten Steigerung der Lymphangiogenese im Vergleich zu Kontroll-Kokulturen führte. Die Reduktion der HIF-1α Expression hatte dabei weder Einfluss auf die Induktion der Angiogenese noch die Zusammenfassung 5 der Lymphangiogenese. Auch der HIF-Doppel-knockdown hatte keine Auswirkungen auf beide Prozesse, was darauf hindeuten könnte, dass zur Adaption an die Hypoxie andere HIF-unabhängige Signalwege, wie z.B. der NF-κB-Signalweg, induziert werden, welche unter anderem auch an der Regulation der Lymphangiogenese und Angiogenese beteiligt sind. Für weitere Experimente wurde daher der Doppelknockdown ausgeschlossen. Im weiteren Verlauf der Arbeit identifizierte ich mithilfe einer Microarray-Analyse mit plasminogen-activator-inhibitor 1 (PAI-1) und insulin-like-growth factor binding protein 1 (IGFBP1) zwei HIF-2α abhängige Faktoren, die im Fall von PAI-1 einen Bezug zur Angiogenese und im Fall von IGFBP1, einem Inhibitior von IGF-1, einen Bezug zur Lymphangiogenese aufweisen. Interessanterweise konnte in diesem Assay keine Regulation der bekannten angiogenen und lymphangiogenen Faktoren wie z.B. den VEGFs, ANG1/2, PDGF-B und deren Rezeptoren nachgewiesen werden. Die Validierung von VEGFA in HepG2 Monolayer Zellen und Sphäroiden zeigte jedoch, dass sowohl ein knockdown von HIF-1α als auch von HIF-2α zu einer signifikanten Reduktion von VEGFA auf mRNA als auch auf Protein Ebene führt. Der Phänotyp der verringerten Angiogenese war jedoch nur in HIF-2α k/d Kokulturen zu beobachten, was darauf hindeutet, dass eine rein transkriptionelle Regulation von VEGFA nicht ausreichend ist, um eine Veränderung des angiogenen Phänotyps hervorzurufen. Weiterhin konnten keine Unterschiede in den VEGFA-Proteinmengen in den Überständen von HIF-1α k/d und HIF-2α k/d Kokulturen detektiert werden. Weiterführende Experimente konzentrierten sich daraufhin auf die Rolle von PAI-1 in HIF-2α induzierter Angiogenese. Zunächst konnte ich mithilfe eines PAI-1 spezifischen, stabilen knockdowns in HepG2 Zellen und den daraus generierten Kokulturen bestätigen, dass die Reduktion von PAI-1 zu einer Reduktion an CD31 positiven Zellen führt und PAI-1 somit die Induktion der Angiogenese in HCC positiv beeinflusst. Da bereits durch zahlreiche Publikationen etabliert wurde, dass PAI-1 die Konversion von Plasminogen in das aktive Plasmin inhibiert, nahm ich für die weiteren Versuche an, dass die Reduktion von PAI-1 zu einem erhöhten Plasmin Level führt. Um einen kausalen Zusamenhang zwischen der Reduktion von HIF-2α, dessen Zielgen PAI-1 und der detektierten Reduktion der Angiogenese zu bestimmen, blockierte ich die Plasmin-Aktivität in HIF-2α k/d Kokulturen, die ein erhöhtes Plasmin Level besitzen sollten, mit Aprotinin. Tatsächlich konnte ich in diesen Kokulturen im Vergleich zu unbehandelten HIF-2α k/d Kokulturen eine Zunahme der Angiogenese auf ein Niveau beobachten, welches dem der Kontroll-Kokulturen entsprach. Daraus folgere ich, dass HIF-2α die entscheidende Rolle bei der Induzierung des „angiogenic switch“ durch die Regulation von PAI-1 und dessen Signalwegs einnimmt. In weiteren Versuchen konnte ich eine Plasmin-abhängige Degradierung von VEGFA165 in PAI-1 und HIF-2α knockdown Sphäroiden nachweisen, welche die Reduktion der Angiogenese in HIF-2α k/d und PAI-1 k/d Kokulturen erklären könnte. Außerdem konnte ich die PAI-1- abhängige und Plasmin-induzierte Apoptose von differenzierenden Stammzellen innerhalb der Kokultur als möglichen Mechanismus zur Regulation der Angiogenese ausschließen. Neben der Funktion von PAI-1 in der Angiogenese überprüfte ich auch dessen Einfluss auf die Lymphangiogenese. Überraschenderweise erzielte ein knockdown von PAI-1 in Kokulturen eine Reduktion der Lymphangiogenese und zeigte somit einem zum HIF-2α knockdown gegensätzlichen Effekt. Die Inhibition von Plasmin in HIF-2α k/d Kokulturen führte jedoch zu einem Rückgang der in unbehandelten HIF-2α k/d Kokulturen erhöhten Lymphangiogenese zurück auf das Level von Kontroll-Kokulturen. Dies deutet darauf hin, dass Plasmin in PAI-1 k/d und HIF-2α k/d Kokulturen eine kontroverse Rolle bei der Induktion der Lymphangiogenese spielt. Ich vermute in diesem Zusammenhang, dass der durch PAI-1 induzierte lymphangiogene Effekt in HIF-2α k/d Kokulturen von anderen entscheidenderen Signalwegen überlagert wird.Allerdings sind weitere Untersuchungen über die Rolle von PAI-1 in der Lymphangiogenese mit besonderem Hinblick auf Invasion und Metastasierung dringend notwendig. Im zweiten Abschnitt meiner Arbeit beschäftigte ich mich mit der Rolle von IGFBP1 in der Lymphangiogenese. Mit Hilfe von Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA)konnte ich zeigen, dass eine HIF-2α-abhängige Regulierung der IGFBP1 Expression sowohl in HepG2 Monolayer Zellen als auch in Tumorsphäroiden signifikant vorliegt. Aufgrund des ähnlichen Expressionsmusters von IGFBP1 mRNA und Protein in Monolayer Zellen und Tumorsphäroiden, entschied ich mich in den weiteren Versuchen mit Monolayer-Überständen zu arbeiten. Mit dem Ziel die Funktion von IGFBP1 in der Regulation der Lymphangiogenese zu studieren, schaltete ich im ersten Schritt das IGFBP1-Gen in HepG2-Monolayer Zellen mittels siRNA aus. Im nächsten Schritt führte ich mit den Überständen von siIGFBP1 behandelten HepG2-Zellen, HIF-2α k/d Zellen und Kontroll-Zellen sprouting assays durch, mit deren Hilfe die Rolle von HIF-2α und IGFBP1 bei der Differenzierung von Stammzellen zu lymphatischen Endothelzellen aufgeklärt werden konnte. Demnach zeigten beide knockdowns eine signifikante Erhöhung der Anzahl an LYVE-1/Podoplanin-positiven und somit lymphatischen Endothelzellen im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollen. Rekombinantes IGF-1 Protein diente als Positivkontrolle und zeigte mit einer signifikant höheren Anzahl an lymphatischen Endothelzellen den deutlichen Einfluss des IGF-1-Systems auf die Lymphangiogenese. Mithilfe eines sogenannten tube formation assays konnte ich Zusammenfassung 7 daraufhin auch den Einfluss von HIF-2α und IGFBP1 auf die Ausbildung von gefäßartigen Strukturen bestimmen. Diese Ergebnisse zeigen somit, dass IGFBP1 ein HIF-2α Zielgen darstellt und eine entscheidende Rolle in der Regulation der Lymphangiogenese in HCC spielt. Da das Ausschalten des IGFBP1 Gens und des HIF-2α Gens zu vergleichbaren lymphangiogenen Phänotypen führte, stelle ich die Hypothese auf, dass HIF-2α die Lymphangiogenese in vitro durch Regulation von IGFBP1 negativ beeinflusst. Um die in vivo Relevanz dieser Beobachtung zu überprüfen, wurden Matrigel Plug Assays durchgeführt, die den entscheidenden negativen Einfluss von HIF-2α auf die Regulation der Lymphangiogenese in vivo bestätigen konnten. Der Zusammenhang zwischen der Regulation der Lymphangiogenese und HIF-2α ist bisher unbekannt und stellt aufgrund der Bedeutung der sekundären Lymphangiogenese für Tumorwachstum und vor allem Metastasierung ein bedeutendes Forschungsprojekt sowie einen Ansatz zur Entwicklung neuer Krebstherapien dar. In zusätzlichen histologischen Versuchen konnte ich außerdem eine signifikant verringerte Apoptose, jedoch eine erhöhte Proliferation in aus HIF-2α k/d Tumorsphäroiden generierten Kokulturen nachweisen. Aufgrund der Funktion des IGFSystems als Inhibitor der Apoptose und Induzierer der Proliferation postuliere ich eineKorrelation zwischen der geringeren Expression von IGFBP1 in HIF-2α k/d HepG2 Zellen und diesen beiden in der Krebsentwicklung entscheidenden Prozessen. Ein weiteres Studium der HIF-2α-Abhängigkeit dieser Prozesse halte ich für wichtig, besonders in Hinblick auf neue aber auch bereits bestehende IGF basierte Therapieansätze. Diese Arbeit deutet auf eine Schlüsselfunktion des Transkriptionsfaktors HIF-2 bei der Regulation von Angiogenese und Lymphangiogenese in HCC hin. Dabei beeinflusst HIF-2 den „angiogenic switch” positiv durch Regulation seines Zielgens PAI-1 und wirkt negativ auf die Induktion der Lymphangiogenese durch die Expression von IGFBP1. Therapeutische Ansätze, die gegen das HIF-2α Gen oder Protein gerichtet sind um die Tumor-Angiogenese in HCC zu reduzieren, sollten daher sorgfältig überdacht und überprüft werden, da ein möglicher Erfolg innerhalb der Tumor-Angiogenese durch induzierte Lymphangiogenese und Metastasierung negativ beeinflusst werden kann oder sich die Krankheits-Prognose dadurch sogar erschlechtern könnte.