Tracking of bacterial metabolism with azidated precursors and click-chemistry

The metabolome of any live cell consists of several hundred, if not thousands of different molecules at any given moment, be it a relatively small bacterial cell or a whole multicellular organism. Although there are cont
The metabolome of any live cell consists of several hundred, if not thousands of different molecules at any given moment, be it a relatively small bacterial cell or a whole multicellular organism. Although there are continuous attempts to differentiate between primary and secondary metabolites, the borders often blur in the eye of almost perfect interconvertability of all such matter. With chemistry and physics dominating this domain of biology it is an interdisciplinary endeavor to tackle the questions surrounding the workings of the metabolic pathways involved, searching for answers that ultimately help us to better understand life and find solutions to problems that affect us humans. One area of biochemistry that serves as a formidable example of the intertwined primary and secondary metabolic pathways are fatty acids, essential components of bacterial membranes, sources of energy and carbon but also important building blocks of several natural products. The second area to be mentioned is the metabolism of amino acids, the basic components of proteins and enzymes, which also serve as precursors to a diverse set of metabolites with many biological purposes. 
This work focuses on these two areas of biochemistry, as several intermediates of their metabolism serve as building blocks for complex secondary metabolites whence many interesting and bioactive natural products are derived. The powerful and relatively novel tool of click-chemistry is employed to track azide-labeled precursors of primary and secondary metabolism in various bacterial strains to observe biochemistry at work and adds to the knowledge gained through other methods. The methods presented in this work serve the observation of fatty acid biosynthesis, degradation, modification and transport through direct ligation of azido fatty acids with cyclooctynes on one hand, leading to a revision of fatty acid transport in general. On the other hand a cleavable azide-reactive resin is devised to generally track the fate of azidated compounds through the myriads of metabolic pathways offered by entomopathogenic bacteria possessing a rich secondary metabolism. The resulting findings led to the identification of several antimicrobial peptides, amides and other compounds of which many had remained so far undetected in the strains that underwent investigation, underlining the worth of this method for future metabolomic research and beyond.
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Eine jede lebendige Zelle produziert zu jedem Zeitpunkt hunderte, wenn nicht tausende von verschiedenen Stoffwechselprodukten, welche verschiedensten Aufgaben dienen. Viele dieser Stoffwechselprodukte dienen allseits bek
Eine jede lebendige Zelle produziert zu jedem Zeitpunkt hunderte, wenn nicht tausende von verschiedenen Stoffwechselprodukten, welche verschiedensten Aufgaben dienen. Viele dieser Stoffwechselprodukte dienen allseits bekannten Aufgaben wie der Energiegewinnung durch Glykolyse, dem Aufbau der Zellmembran oder der Informationsspeicherung in Form von DNS oder RNS, jedoch sind die Verwendungszwecke vieler der dabei auftretenden Intermediate bei weitem nicht auf diese Aufgaben beschränkt. So wird immer wieder versucht eine Trennung zwischen diesen primären und allen nicht dazu gerechneten, sekundären Stoffwechselwegen (Herstellung von Antibiotika, Botenstoffen, etc.) gemacht, dabei sind diese Stoffwechselwege eng miteinander verwoben und die Unterscheidung spielt aus Sicht des betroffenen Organismus keine Rolle. Die Klärung dieser Stoffwechselwege steht im Zentrum vieler biologischer Fragestellungen und die Tatsache, dass diese Welt der Moleküle von Physik und Chemie beherrscht wird macht deren Erforschung zu einem interdisziplinären Feld, das uns Antworten sowohl über das Leben im allgemeinen, als auch zu Fragen rund um die menschliche Gesundheit und andere praktische Anwendungen erbringt. Wie sich diese verschiedenen Gebiete gegenseitig ergänzen wird klar, wenn man berücksichtigt, dass die meisten Pharmazeutika, die seit frühester Zeit bis heute im Einsatz sind, letztlich auf Naturstoffen basieren. Bioaktive Naturstoffe werden von ihren jeweiligen Produzenten hergestellt, um sich konstruktiv oder destruktiv mit ihrer Umwelt auseinanderzusetzen, und so wie die Umwelt seit Anbeginn der Zeit einem steten Wandel unterliegt, so mussten dies auch die zum Einsatz gebrachten Naturstoffe tun. Das Verständnis der Biosynthese solcher Naturstoffe, sowie die breite Erfassung ihrer Diversität und natürlicher Anwendungsgebiete erlaubt somit einen Einblick in prinzipielle Methoden der Natur zur Erreichung diverser Ziele. Wann immer ein solches Ziel mit einem der von uns gesetzten übereinstimmt, etwa bei der Entwicklung neuer Antibiotika, so wird der Wert des Verständnisses der in diesem Gebiet sehr erfahrenen Natur offensichtlich. Ein Bereich der Biochemie, der als hervorragendes Beispiel für die enge Verstrickung primärer und sekundärer Stoffwechselwege dient, ist der Fettsäuremetabolismus als essentieller Bestandteil der Membranbiosynthese und als Zugang zu einer ergiebigen Kohlenstoff- und Energiequelle im Herzen des zellulären Stoffwechsels. Ein weiterer Bereich, der hier Erwähnung finden soll, ist der Stoffwechsel der Aminosäuren, welche die Grundbausteine von Proteinen, Enzymen und darüber hinaus von Vorstufen etlicher weiterer Stoffwechselprodukte sind. So findet man zahlreiche nicht-proteinogene Aminosäuren, wie deren D-Epimere oder Ornithin, in nicht-ribosomalen Peptiden eingebaut, während verschiedene Aminosäureabbauprodukte auch in Polyketiden oder andern kleinen bioaktiven Substanzen Verwendung finden. 
Die Methoden, die der Wissenschaft zur Untersuchung dieser Stoffwechselwege und der ihnen entspringenden Substanzen zur Verfügung stehen sind zahlreich und umfassen radiometrische, chromatographische, spektrometrische, spektroskopische und weitere Methoden, die teils seit langer Zeit im Einsatz sind. Nichtsdestotrotz ist eine jede Methode auch mit Nachteilen behaftet, die erst durch neue Erfindungen oder komplementäre Experimente überwunden werden können. Die Entwicklung der noch relativ jungen und mächtigen Technik der Klick-Chemie feiert dabei große Erfolge, da sie die bestehenden Methoden mit einem hohem Maß an Selektivität und Zuverlässigkeit bereichert, so dass insbesondere der Bereich des Biolabeling jüngst enorme Fortschritte erfahren konnte. Bis dato lag das Hauptaugenmerk dabei auf der Markierung von Proteinen und anderen Makromolekülen zur Sichtbarmachung oder Isolation derselben in teils lebendigen Systemen. Letzteres wurde insbesondere durch den Einsatz ringgespannter Alkine in Verbindung mit Aziden in einer 1,3-dipolaren Cycloaddition, das bekannteste Beispiel der sogenannten bioorthogonalen Klick-Chemie, ermöglicht. Die Vorzüge besonders letzterer Technik wurden bisher allerdings kaum auf die Verfolgung des Schicksals kleiner Moleküle und ebenso kleiner Folgeprodukte angewendet. 
In der hier vorliegenden Arbeit wird die Klick-Chemie in Verbindung mit azid-markierten Vorläuferstufen verschiedenster Naturstoffe eingesetzt um das Repertoire biochemischer Analytik zu erweitern und dabei auch neue Substanzen zu entdecken, die mit klassischen Methoden allzu leicht übersehen werden konnten. 
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Metadaten
Author:Alexander José Pérez
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-391619
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Helge Björn Bode, Joachim W. Engels
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/01/22
Year of first Publication:2015
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2016/01/14
Release Date:2016/01/22
Pagenumber:191
HeBIS PPN:369041453
Institutes:Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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