Functional role of OPA1 in mitochondrial membrane structure and quality control

Mitochondrial membrane dynamics is increasingly implicated in various human diseases. Numerous studies show that the protein OPA1 plays a central role in determining mitochondrial ultrastructure and apoptotic remodeling 
Mitochondrial membrane dynamics is increasingly implicated in various human diseases. Numerous studies show that the protein OPA1 plays a central role in determining mitochondrial ultrastructure and apoptotic remodeling of the inner mitochondrial membrane during Cytochrome c release and apoptosis. Crista junctions are crucial for the regulation of apoptotic Cytochrome c release. Previous publications suggest that OPA1 is required to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. The protein MIC60 (Mitofilin) appears to be an essential physical constituent of crista junctions and is also crucial for the general determination of mitochondrial ultrastructure. Furthermore, recent studies suggest that MIC60 is also implicated in Cytochrome c release during apoptosis.
In this regard, the question whether OPA1 is essential for crista junction formation was investigated. In addition to that, the interplay between OPA1 and MIC60 and its physiological role were analyzed. Electron microscopy of OPA1+/- and OPA1+/+ mice, as well as of OPA1-/- and OPA1+/+ MEFs clearly showed that OPA1 plays a role but is not essential for crista junction formation. In contrast to that, the results indicate that OPA1 is crucial to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. Immunogold experiments fit well to these observations as OPA1 was found equally distributed throughout the cristae membrane with only a minor part located at crista junctions. MIC60 localization studies showed a clear enrichment at crista junctions. Interaction studies revealed that endogenous OPA1 and MIC60 physically interact with each other. Analysis of protein levels upon OPA1 or MIC60 depletion indicate that both proteins play a dual role in cristae- and crista junction formation in which MIC60 is a physical constituent of crista junctions essential for their formation while OPA1 primarily has a regulatory impact on MIC60 function. Finally, apoptosis assays and cell viability measurements showed that knockout of OPA1 in MEFs leads to increased cellular resistance suggesting that the interplay of these proteins is important for the regulation of crista junction remodeling during apoptosis.
Besides its role in determining mitochondrial ultrastructure, OPA1 mediates inner membrane fusion of mitochondria thereby contributing to mitochondrial quality control. Additionally, proteolytic processing is crucial for the ability of OPA1 to distinguish between functional and dysfunctional mitochondria. Functional mitochondria are fused while dysfunctional mitochondria are not, a process termed selective mitochondrial fusion. Dysfunctional mitochondria were shown to be degraded by mitophagy in a fission-dependent manner. Numerous studies suggest that OPA1 and mitophagy are directly linked. However, this idea is still under debate. Mitophagy is also crucial for mitochondrial quality control, which directly impacts mitochondrial integrity. Furthermore, mitochondrial quality control has been linked to neurodegeneration as demonstrated by the observation that mutations in OPA1 cause the disorder ADOA-1.
In order to analyze a potential link between OPA1 and mitophagy, mitochondrial colocalization with LC3 was analyzed microscopically in primary adult skin fibroblasts isolated from OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner. Fibroblasts from young OPA1+/- mice showed increased colocalization of mitochondria with autophagosomes compared to fibroblasts from young wild type mice suggesting that OPA1 exerts an inhibitory role in mitophagy. This effect was even more pronounced in old mice, which also displayed higher mitophagy levels in general than young mice, consistent with the finding that old mice had higher Parkin levels than young mice. Mitochondrial fragmentation was elevated in fibroblasts from young and old OPA1+/- mice compared to control fibroblasts. However, extensive mitochondrial fusion, which occurred in fibroblasts from old wild type mice, was prevented in old OPA1+/- mice. Furthermore, old wild type mice had decreased numbers of crista junctions compared to young wild type mice, an effect that was not observed in OPA1+/- mice. Despite the observed age-dependent phenotypes in mitochondrial quality control and mitochondrial integrity, deletion of one allele of OPA1 had no influence on the life span in vivo. Analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice, which was performed in collaboration with Ansgar Poetsch and Carina Ramallo-Guevara from Bochum, showed that OPA1-dependent aging is accompanied by a reduction of proteins involved in autophagy. In contrast to that, a switch from glucose to fatty acid metabolism and alterations in apoptotic proteins were observed in both OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner indicating that the changes in proteins implicated in autophagy could be a compensatory response to the diminished inhibitory effect of OPA1 on mitophagy. On the other hand, increased mitochondrial degradation by mitophagy could be a cellular response to itself compensating for the loss of OPA1 mediated fusion thereby contributing to the observation that OPA1+/- and OPA1+/+ mice had no differences in life span. Furthermore, analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice revealed that OPA1, besides its role in mitochondrial fusion, could interact with the fission machinery: MFF and Neuronal pentraxin 1, two proteins involved in mitochondrial fission, were up-regulated in 12-month-old OPA1+/- mice suggesting that a reduced fission activity could contribute to mitochondrial hyperfusion in aged wild- type mice. Nonetheless, the exact nature of the possible interplays between OPA1 and these candidates remains to be investigated.
show moreshow less
Mitochondrien bilden ein hochdynamisches Netzwerk, welches durch ständige Fusions- und Teilungsereignisse aufrechterhalten wird. Diese Vorgänge sind Teil eines Qualitätskontrollsystems, welches es ermöglicht, dysfunktion
Mitochondrien bilden ein hochdynamisches Netzwerk, welches durch ständige Fusions- und Teilungsereignisse aufrechterhalten wird. Diese Vorgänge sind Teil eines Qualitätskontrollsystems, welches es ermöglicht, dysfunktionale Mitochondrien zu erkennen und vom Netzwerk zu separieren. Auf diese Weise soll gewährleistet werden, daß sich mitochondriale Schäden nicht ausbreiten und somit die Integrität des mitochondrialen Netzwerks gefährden können. Außerdem erlaubt diese Separierung die Entfernung dysfunktionaler Mitochondrien durch selektive Autophagie, ein Vorgang der Mitophagie genannt wird. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde gezeigt, daß das Protein OPA1 (Optic atrophy 1) eine essentielle Rolle für die Fusion von Mitochondrien spielt. Offen blieb jedoch bislang die Frage, ob ein OPA1-vermittelter Fusionsstop ausreicht, um Mitophagie zu induzieren. Neben seiner Funktion bei der mitochondrialen Qualitätskontrolle, konnte in älteren Studien gezeigt werden, daß OPA1 ein notwendiger Faktor für die Bildung und Aufrechterhaltung mitochondrialer Cristae ist. Verschiedene Studien deuten außerdem darauf hin, daß es auch an der Bildung von Crista Junctions beteiligt sein könnte. Mitochondriale Membrandynamik und Qualitätskontrolle werden zunehmend mit zahlreichen humanen Krankheiten sowie Alterung in Verbindung gebracht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle von OPA1 bei der Crista Junction Bildung näher untersucht. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen einer heterozygoten OPA1-Maus sowie von OPA1-/- MEF-Zellen, konnte zum ersten Mal eindeutig gezeigt werden, daß OPA1 zwar an der Bildung von Crista Junctions beteiligt ist, jedoch kein notwendiger Faktor ist. So wurde in OPA1-/- MEF-Zellen zwar eine Verringerung der Anzahl an Crista Junctions im Vergleich zu Wildtyp-Zellen festgestellt, jedoch kein komplettes Verschwinden. Zusätzlich wurde mit Hilfe von Immunold Elektronenmikrospie gezeigt, daß OPA1 zwar an Crista Junctions vorkommt, allerdings nicht dort angereichert ist. Zur Kontrolle wurde zusätzlich die Lokalisation der Proteins MIC60 bestimmt, welches eine essentielle Komponente bei der Crista Junction Bildung ist. Im Gegensatz zu OPA1, war MIC60 in angereicherter Form im Bereich der Crista Junctions zu finden. Weiterhin konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß OPA1 und MIC60 auf endogener Ebene physikalisch miteinander interagieren. Außerdem führte der Knockout von OPA1 in MEFs zu einer Erhöhung der MIC60 Protein Level sowie zu einer verstärkten Resistenz gegenüber Staurosporine-induzierter Apoptose. Diese Ergebnisse deuten auf eine duale Rolle von OPA1 und MIC60 bei der Bildung und Dynamik von Crista Junctions hin. Passend hierzu zeigten Immunogold-Analysen beider Proteine eine partielle Überlappung im Bereich der Crista Junctions. MIC60 stellt hierbei eine grundlegende strukturelle Komponente dar, während OPA1 primär regulatorisch wirksam zu sein scheint. Weiterhin erscheint die Interaktion für die Regulation der Cytochrom c Freisetzung während der Apoptose wichtig. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Zusammenhänge zwischen OPA1, mitochondrialer Qualitätskontrolle und Alterung untersucht. Hierzu wurde ein heterozygotes OPA1 Mausmodell untersucht. Zunächst konnte mit Hilfe primärer adulter Hautfibroblasten gezeigt werden, daß eine Reduktion der OPA1 Protein Level eine erhöhte Fragmentierung des mitochondrialen Netzwerks in jungen und alten Mäusen zur Folge hat. Auffällig dabei war, daß etwa 20 % der Fibroblasten aus alten Wildtyp Mäusen hyperfusionierte Mitochondrien hatten. Diese Hyperfusionierung war nicht in Fibroblasten aus alten OPA1+/- Mäusen zu sehen. Um einen möglichen Link zwischen OPA1 und Mitophagie zu entdecken, wurde die Kolokalisation von Mitochondrien mit Autophagosomen mikroskopisch erfasst. Sowohl Fibroblasten aus 3-, als auch aus 18-Monate alten OPA1+/- Mäusen wiesen eine erhöhte Kolokalisation im Vergleich zu Wildtyp Fibroblasten auf. Dieser Effekt war in Fibroblasten aus 18-Monate alten Mäusen etwas stärker ausgeprägt als in Zellen aus 3-Monate alten Mäusen. Außerdem wurde festgestellt, daß Alterung alleine die Mitophagierate deutlich stärker erhöht als eine Reduktion von OPA1. Zusätzlich konnten sowohl in OPA1+/- als auch in OPA1+/+ Fibroblasten aus 18-Monate alten Mäusen erhöhte Level des Proteins Parkin nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen erstmalig, daß eine OPA1-vermittelte Fragmentierung von Mitochondrien die Induktion von Mitophagie stimuliert. Außerdem scheint die Rolle von OPA1 bei der Qualitätskontrolle von Mitochondrien alterungsabhängig zu sein. Weiterhin wurde gezeigt, daß die Anzahl an Crista Junctions im Alter abzunehmen scheint. Dieser Effekt war nicht in OPA1+/- Mäusen zu sehen. Schließlich wurde gezeigt, daß OPA1+/- Mäuse, trotz der beschriebenen alterungsabhängigen Veränderungen, keinen Unterschied in der Lebensspanne im Vergleich zu Wildtyp Mäusen haben. Um potentielle OPA1-Interaktoren zu identifizieren, wurde des Weiteren eine quantitative alterungs- und OPA1-abhängige Analyse des Mitochondrialen Proteoms in Kooperation mit Ansgar Poetsch aus Bochum durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Studie sind der Arbeit selbst zu entnehmen.
show moreshow less

Export metadata

  • Export Bibtex
  • Export RIS
Metadaten
Author:Michael Barrera Estevez
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-413252
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Amparo Acker-Palmer, Andreas Reichert
Advisor:Andreas Reichert
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/07/20
Year of first Publication:2016
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2016/07/06
Release Date:2016/07/20
Pagenumber:198
HeBIS PPN:384812600
Institutes:Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $