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Christina Helmling

• Riboswitches are an important class of regulatory RNA elements that respond to cellular metabolite concentrations to regulate gene expression in a highly selective manner. 2’-deoxyguanosine-sensing (2’dG) riboswitches represent a unique riboswitch subclass only found in the bacterium Mesoplasma florum and are closely related to adenine- and guanine-sensing riboswitches. The I-A type 2’dG-sensing riboswitch represses the expression of ribonucleotide reductase genes at high cellular concentrations of 2’dG as a result of premature transcription termination. Increasing evidence within the last decade suggests that transcriptional regulation by riboswitches is controlled kinetically and emphasizes the importance of co-transcriptional folding.2–4 Addition of single nucleotides to nascent transcripts causes a continuous shift in structural equilibrium, where refolding rates are competing with the rate of transcription.5,6 For transcriptional riboswitches, both ligand binding and structural rearrangements within the expression platform are precisely coordinated in time with the rate of transcription. The current thesis investigates the mechanistic details of transcriptional riboswitch regulation using the I-A 2’dG-sensing riboswitch as an example for a riboswitch that acts under kinetic control.
• Riboschalter sind wichtige regulatorische RNA Elemente, die durch selektive Binding von Metaboliten (Liganden) die Genexpression in Bakterien regulieren können. Riboschalter, die den Metaboliten 2‘-desoxyguanosin (2’dG) binden, wurden bislang nur in dem Bakterium Mesoplasma florum gefunden und gehören zur Klasse der purin-bindenden Riboschalter. Im Falle des Typ I-A 2’dG-bindenden Riboschalters führen hohe zelluläre Konzentrationen von 2’dG zu einer vorzeitigen Terminierung der Transkription. Dadurch wird der nachfolgende codierende Bereich für das Enzym Ribonukleotid Reduktase nicht transkribiert und somit die Genexpression verhindert. Studien an Riboschaltern, bei denen die Genexpression auf der Ebene der Transkription reguliert wird, haben gezeigt, dass die Regulation primär durch Faltungskinetiken und nicht durch thermodynamische Gleichgewichte bestimmt wird. Dabei spielt co-transkriptionelle Faltung eine wichtige Rolle.2–4 Wird die RNA während der Transkription am 3‘-Ende durch einzelne Nukleotide verlängert, führt dies zu einer kontinuierlichen Erweiterung möglicher Strukturen, die angenommen werden können. Dabei konkurrieren Umfaltungsraten zur thermodynamisch stabilsten Struktur mit der Transkriptionsrate.5,6 Daher können während der Transkription über einen gewissen Zeitraum Strukturen angenommen werden, die nicht der thermodynamisch stabilsten Struktur entsprechen, sondern kinetisch stabilisiert sind. Solche Strukturen haben sich für viele RNA-basierte regulatorische Prozesse als relevant erwiesen.2,188–196 In Riboschaltern sind sowohl die Ligandenbindung als auch die Umfaltung der Expressionsplattform zeitlich direkt mit der Transkription koordiniert (Abbildung 1). Während der Transkription faltet zunächst die Ligandenbindungsdomäne (Aptamer). Direkt im Anschluss bestimmt die zelluläre Ligandenkonzentration, ob die RNA den OFFFaltungspfad oder den ON-Faltungspfad einschlägt. Um die Genexpression auszuschalten, muss die Ligandenbindung zeitlich vor der Synthese des 3‘-Antiterminatorstranges (rot) erfolgen, damit die Terminatorhelix (rot:grün) ausgebildet werden kann. Wird die Aptamerdomäne (orange:blau) nicht vor der Synthese des roten Segments durch Ligandbindung stabilisiert, bildet sich die Antiterminatorhelix (blau:rot) und der Riboschalter befindet sich im ON-Faltungspfad. Gleichzeitig muss die Faltung der Antiterminatorhelix (blau:rot) zeitlich vor der Synthese des 3‘-Terminatorstranges (grün) erfolgen um die Bildung der Terminatorhelix (rot:grün) in Abwesenheit des Liganden zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurde die zeitliche Koordination dieserFaltungsereignisse in Relation zur Transkriptionsrate anhand des kinetisch kontrollierten 2’dG-bindenden Riboschalters aus M.florum detailliert untersucht.Zunächst wurden ON- und OFF-Zustand des 2’dG-bindenden Riboschalters mittels NMRSpektroskopie strukturell charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass der Riboschalter voller Länge sowohl im liganden-gebundenen und im liganden-freien Zustand die Terminatorhelix ausbildet und in beiden Fällen den regulatorischen OFF-Zustand annimmt. Der ON-Zustand konnte nur durch Verkürzung der RNA um das grüne Segment in Abbildung 1 in einem Transkriptionsintermediat (122 nt) stabilisiert und identifiziert werden. Mittels struktureller NMR Analyse konnten zwei Konformationen im regulatorischen ON-Zustand nachgewiesen werden, die auf einer Zeitskala von >1 s austauschen. Weiterhin unterschied sich der 2’dG-bindende Riboschalter bezüglich der liganden-abhängigen allosterischen Modulation von den verwandten Guanin- und Adeninbindenden Riboschaltern (Abbildung 2). Um herauszufinden, ob dieses Umfaltungsmuster charakteristisch für 2’dG-bindende Riboschalter oder spezifisch für das Bakterium M.florum ist, wurden zwei weitere Riboschalter aus dem Bakterium M.florum untersucht: der I-B 2’dG-bindende Riboschalter und der III-B Guanin-bindende Riboschalter. Strukturelle Untersuchungen mittels NMR-spektroskopie ergaben, dass die allosterische Modulation in allen M.florum Riboschaltern identisch ist und daher nicht der Ligandenklasse zugeordnet werden kann. Weiterhin wiesen die NMR-spektroskopischen Untersuchungen darauf hin, dass der I-B 2’dG-bindendende Riboschalter analog zu dem IA 2’dG-bindenden Riboschalter zwei Konformationen im ON-Zustand annimmt.Im Anschluss an die strukturelle Charakterisierung des I-A 2’dG-bindenden Riboschalters wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, eine Vielzahl an Transkriptionsintermediaten parallel und schnell zu synthetisieren. Mit dieser Methode sollte schrittweise verfolgt werden, wie sich Strukturen durch Verlängerung der RNA durch einzelne Nukleotide verändern können, und somit der Transkriptionsprozess rekonstruiert werden. Der konventionelle Prozess der RNA Herstellung durch in vitro Transkription konnte dabei in zwei Schritten verbessert und beschleunigt werden. Zunächst werden bei run-off-Transkriptionen mit T7 Polymerase 1-2 zufällige Nukleotide an das 3‘-Ende angehängt. Die Addition zufälliger Nukleotide wird typischerweise durch die Verwendung von Ribozymen verhindert, die sich während der Transkription selbst abschneiden. Die Verwendung von Ribozymen hingegen verlangsamt und kompliziert den Prozess der RNA Synthese. Weiterhin sind standardisierte Aufreinigungsverfahren für RNA, wie HPLC und PAGE, zeitaufwändig und können nicht parallel durchgeführt werden. Die 3‘-Homogenität von run-off-Transkriptionen konnte durch die Verwendung von DMSO als Zusatzlösemittel signifikant verbessert werden. Wurde DMSO in Kombination mit DNA-Templaten, die 2‘-Methoxy Modifikationen an den letzten zwei 5‘-Nukleotiden enthielten,7 eingesetzt, wurde die zufällige Addition von Nukleotiden an das 3‘-Ende der RNA komplett unterbunden. Diese Transkriptionsbedingungen lieferten sehr reine und homogene RNA, so dass die Transkriptionsmischung direkt in Zentrifugalkonzentratoren gewaschen und umgepuffert werden konnten. Die resultierenden NMR-Spektren wiesen eine vergleichbare Qualität zu Spektren auf, die von HPLC oder PAGE aufgereinigten Proben aufgenommen wurden. Der beschleunigte Prozess der RNA Synthese ermöglichte es, eine Vielzahl an Transkriptionsintermediaten innerhalb von zwei Tagen herzustellen und kann in drei Schritte gegliedert werden (Abbildung 3): Zunächst werden DNA Template durch PCR unter Variation der Rückwärts-Primer innerhalb von zwei Stunden hergestellt.Anschließend werden Transkriptionen auf Basis der PCR-Produkte über Nacht durchgeführt. Im letzten Schritt wird die Transkriptionsmischung in Zentrifugalkonzentratoren für ca. 8-10 Stunden mit Wasser gewaschen und anschließend umgepuffert.Mit der entwickelten Methode wurden 29 Transkriptionsintermediate parallel synthetisiert und biophysikalisch hinsichtlich Struktur und Ligandenbindungseigenschaften untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abbildung 4 zusammengefasst. Zunächst wurde die Sekundärstruktur der Transkriptionsintermediate in Abwesenheit von 2’dG mittels NMR-Spektroskopie bestimmt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich der ON-Zustand über eine Spanne von 24 Nukleotiden zwischen den Transkriptionslängen von 113 und 137 Nukleotiden ausbildet. Demzufolge muss die Umfaltung in den ON-Zustand auf der gleichen Zeitskala erfolgen, wie die Transkription dieser 24 Nukleotide um die Genregulation in Abwesenheit des Liganden anzuschalten. Ab einer Transkriptionslänge von 139 Nukleotiden verschiebt sich das thermodynamische Gleichgewicht in den OFFZustand. Da die Entscheidung über den Transkriptionsverlauf 5 Nukleotide später erfolgt, muss der metastabile ON-Zustand nur über diesen begrenzten Zeitraum kinetisch stabilisiert werden. Anschließend wurde überprüft, über welchen sequentiellen Bereich der Ligand stabil an die Aptämerdomäne binden kann. NMR-spektroskopische Untersuchungen zeigten, dass der liganden-gebundene Zustand nur in der einzelnen Aptamerdomäne zu >90% über einen Sequenzbereich von 10-13 Nukleotiden (Transkriptionslängen 80-93) angenommen wird.Eine Verlängerung der RNA führt zu einer kontinuierlichen Abnahme (bis zu 70%) des liganden-gebundenen Zustands über die folgenden 20 Nukleotide bis zu einer Transkriptionslänge von 113 Nukleotiden. Der Riboschalter voller Länge bindet den Liganden ebenso nur zu 70%. Die NMR Ergebnisse konnten durch Bestimmung der Dissoziationskonstante mittels ITC für einige selektierte Transkriptionsintermediate bestätigt werden. Auch wurden Ligandenbindungskinetiken mittels Stopped-Flow Fluoreszenz Spektroskopie gemessen. Diese Experimente zeigten, dass sich die Rate der Ligandenbindung mit einer Verlängerung der RNA nicht verändert, insofern die Aptamer Domäne als stabilste Struktur vorliegt. Daraus folgt, dass die Rate der Ligandenbindung ausschließlich durch Fluktuationen in der zellulären 2’dG Konzentration reguliert wird. Da die Ligandenbindung eine Kinetik zweiter Ordnung ist, wird durch eine Erhöhung der Ligandenkonzentration direkt die Bindungsrate beschleunigt. Demensprechend wird bei höheren 2’dG Konzentrationen der liganden-gebundene Zustand durch schnellere Bindung stärker populiert. Der sinkende Populationsverlauf des liganden-gebundenen Zustands mit zunehmender Transkriptionslänge reflektiert somit direkt eine Feinabstimmung der liganden-abhängigen Regulation. Weiterhin zeigen die Ergebnisse, dass die kritische zelluläre Ligandenkonzentration und die daraus resultierende Bindungsrate, die benötigt wird um die Genregulation auszuschalten, der Syntheserate von ca. 30 Nukleotiden entsprechen muss. Ausgehend von Transkriptionsraten für bakterielle RNA Polymerasen, liegt diese Rate im Bereich von 0.3 - 3 s-1.9–11 Zuletzt wurde die Umfaltungsrate von der Aptamerdomäne zum ON-Zustand experimentell bestimmt. Dazu wurde das verkürzte, ON-Zustand stabilisierte Transkriptionsintermediat (122 Nukleotide), hergestellt und durch photolabile Schutzgruppen in der Expressionplattform dazu gebracht, die Aptamer Konformation anzunehmen. Zur Herstellung des Konstruktes wurde ein modifiziertes Fragment (36 nt), hergestellt durch Festphasensynthese, an ein isotopenmarkiertes Fragment (85 nt), hergestellt durch in vitro Transkription, enzymatisch ligiert. Licht-induzierte Spaltung der photolabilen Schutzgruppen initiiert somit eine Umfaltung von der Apatmerdomäne in den ON-Zustand. Die kinetischen Experimente zeigten, dass die liganden-freie Aptamerdomäne mit einer Rate von 1.3 s-1 und die liganden-gebundene Aptamerdomäne mit einer Rate von 0.08 s-1 in den ON-Zustand faltet. Während die liganden-freie Aptamerdomäne auf der gleichen Zeitskala in den ON-Zustand faltet, auf der die RNA Polymerase die Nukleotide 113-137 synthetisiert (0.4 - 3.7 s-1), ist die Umfaltungsrate im liganden-gebundenen Zustand im Vergleich zur Transkriptionsrate zu langsam.Simulationen zur co-transkriptionellen Faltung auf Basis dieser Ergebnisse zeigten, dass der I-A 2’dG-bindende Riboschalter die Genexpression nur in einem Bereich von ~50% regulieren kann und dabei auf charakteristische bakterielle Transkriptionsraten angewiesen ist (10-90 nt/s9–11). Folglich ist das traditionelle Modell eines binären AN/AUS Schalters stark vereinfacht. Im Gegensatz dazu werden Populationsverhältnisse durch kontinuierliche Verlängerung der RNA während der Transkription angepasst und durch subtile Fluktuation in der Ligandenkonzentration abgestimmt.