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Berta Sanchez de Juan

• The use of doxorubicin for the treatment of glioma tumours would be an important approach in the chemotherapy treatment since doxorubicin is a very effective neoplastic agent. However, one problem faced by the use of doxorubicin for the treatment of brain tumours is the fact that doxorubicin is a substrate of an efflux pump protein, P-glycoprotein (P-gp), which is located on the luminal side of the brain capillary endothelium and in many tumour cells, which acts pumping out of the cell such substrate, and blocking its transport into the cell. A strategy to enhance the doxorubicin delivery into the brain would be the use of nanoparticles. This work showed, that the treatment of doxorubicin bound to poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles decreased the viability of the three glioma cell lines, the GS-9L, the RG-2, and the F-98 cell lines significantly in comparison to doxorubicin in solution, indicating an improvement of the nanoparticles-bound doxorubicin transport into the cells. The modification of the nanoparticles surface with different surfactants may even enhance the delivery of the drug into the cells. Searching for an improvement of the doxorubicin internalization, the nanoparticles surface was modified using polysorbate 80, poloxamer 188 and poloxamine 908 surfactants. The poloxamer 188 and polaxamine 908 surfactant modified nanoparticles did not show a significant enhancement of the doxorubicin internalization. Contrary, the treatment of polysorbate 80 surfactant modified nanoparticles led in some cases to a significant decrease of cancer cell viability. The use of doxorubicin in the three glioma cell lines allowed the measurement of different responses towards doxorubicin treatment. The different responses were due to the entry of various amounts of doxorubicin into the glioma cells, which express the P-glycoprotein in their cellular membrane. A higher level of the P-gp expression correlated with a weaker response towards the doxorubicin treatment. The GS-9L cell line showed a significant higher level of P-gp expression than the F-98, and RG-2 cell lines, and consequently, the GS-9L cell line presented the highest resistance to doxorubicin with the highest viability values after doxorubicin treatment. Due to the fact that the transport of doxorubicin is governed by the activity of the P-gp in the studied glioma cells, the use of poloxamer 185 as a P-gp inhibitor resulted in an enhancement of the uptake as well as of the accumulation of doxorubicin into the cells. The effect of poloxamer 185 on the doxorubicin uptake was significant marked in the case of doxorubicin-resistance cells, as the GS-9L cell line. In some cases, the presence of the nanoparticles formulation showed also an influence on such uptake improvement. The use of a P-gp inhibitor in combination with chemotherapeutic agents leads to encouraging results. Because of the wide spectrum of substances acting as P-gp inhibitors, the exact inhibitory mechanisms remain still unclear. For instance in our results the evaluation of a described P-gp inhibitor, polysorbate 80 did not show an important improvement in the doxorubicin uptake in the P-gp-expressing cell line, GS-9L. On the other hand, the Polysorbate 80-Dox-PBCA nanoparticles formulation decreased in greater extend the viability of the glioma cells than the poloxamer185-Dox-PBCA nanoparticles. Although, the P-gp inhibition was undoubtedly higher in the presence of poloxamer 185, polysorbate 80 showed a main effect on the disruption of the cellular membrane, resulting in an important cellular viability decrease. It seems that poloxamer 185 presents a direct effect on the functionality of the P-gp protein, which would be of great importance in the sensitization of resistant cancer cells. The range of concentration of poloxamer 185 is very important to yield an inhibitory effect on the P-gp-mediated transport mechanism. The accumulation of Rhodamine-123 (Rho-123), a known P-gp substrate, increased in a range of concentration from 0.001 % to 0.01, whereas at 0.1 % poloxamer 185 the accumulation significantly decreased. A maximal Rho-123 accumulation was reached at 0.01 % poloxamer 185.
• Die Verwendung von Doxorubicin stellt einen wichtigen therapeutischen Ansatz in der chemotherapeutischen Behandlung von Tumoren gliomalen Ursprungs dar, da sich Doxorubicin bereits als sehr effektiver neoplastischer Wirkstoff erwiesen hat. Es besteht jedoch das Problem, dass Doxorubicin durch das Multidrug Resistenzprotein P-gp, sowohl aus den Endothelzellen der Blut-Hirn Schranke, als auch aus Gerhirntumorzellen entfernt wird. P-gp ist in der Membran dieser Zellen lokalisiert und pumpt Doxorubicin und andere Substrate in einem ATP-abhängigen Prozess aus der Zelle. Eine Möglichkeit die Doxorubicin Applikation im Gehirn zu verbessern ist die Verwendung von Nanopartikeln. Diese Arbeit konnte zeigen, dass die Wirkung von Doxorubicin durch die Bindung an Poly(butyl-cyanoakrylat) Nanopartikel im Vergleich zu freiem Doxorubicin in Lösung signifikant gesteigert werden konnte. So konnte die Anzahl an lebenden Zellen durch eine Behandlung der Glioma Zelllinien GS-9L, RG-2 und F-98 mit Doxorubicin-beladenen Nanopartikeln signifikant erniedrigt werden, was für einen erhöhte effektive Doxorubicin-Konzentration in den Zellen spricht. Die Modifikation der Oberfläche der Nanopartikel mit unterschiedlichen Surfaktantien könnte das Einbringen von Doxorubicin in die Zielzellen zusätzlich erhöhen. Bei der Suche nach einer verbesserten Doxorubicin Internalisation wurde die Oberfläche der Nanopartikel mit Polysorbat 80, Poloxamar 188 und Poloxamin 908 Surfaktantien modifiziert. Die mit Poloxamer 188 und Polaxamin 908 Surfaktantien modifizierten Nanopartikel zeigten keine signifikante Verbesserung der Doxorubicin Internalisation in die Zellen. Im Gegensatz dazu konnte eine signifikante Reduktion der lebenden Krebszellen durch die Behandlung von Polysorbat 80-modifizierten Nanopartikeln beobachtet werden. Die Behandlung von drei unterschiedlichen Glioma Zelllinien mit Doxorubicin erlaubte verschiedene Wirkungen von Doxorubicin zu beobachten. Die verschiedenen Wirkungen wurden durch eine unterschiedliche Aufnahme von Doxorubicin in diese Zellen verursacht, die das P-gp Protein in ihrer Zellmembran exprimieren. Hierbei korrelierte eine erhöhte P-gp Expression mit einer schwächeren Doxorubicin Wirkung. Die Zelllinie GS-9L zeigte eine signifikant höhere P-pg Expression als die F-98 und RG-2 Zellen. Konsequenterweise wurde in dieser Zelllinie die höchste Doxorubicin Resistenz ermittelt mit den höchsten Werten an überlebenden Zellen nach Doxorubicin Behandlung. Da der Transport von Doxorubicin aus den Glioma Zellen mit der Aktivität des P-gp Proteins korreliert, konnte durch die Verwendung des P-gp Inhibitors Poloxamer 185 eine verbesserte Aufnahme und Akkumulation von Doxorubicin in den Zellen erreicht werden. Dieser Effekt der verbesserten Doxorubicin Aufnahme konnte besonders gut in den Doxorubicin-resistenten GS-9L Zellen beobachtet werden. In einigen Fällen konnte auch ein verbesserte Aufnahme durch die Verwendung der Nanopartikel beobachtet werden. Die Verwendung von P-gp Inhibitoren in Kombination mit chemotherapeutischen Agentien führten zu ermutigenden Resultaten. Durch das grosse Spektrum an Substanzen die in der Lage sind das P-gp Protein zu inhibieren, ist der exakte Mechanismus der Inhibition weiterhin ungeklärt. Zum Beispiel konnte die Verwendung des als P-gp Inhibitor beschriebenen Polysorbat 80, die Aufnahme von Doxorubicin in GS-9L Zellen nicht erhöhen. Allerdings wurde die Zahl an lebenden Glioma Zellen durch die Behandlung mit Polysorbat 80-dox-PBCA Nanopartikeln stärker reduziert, als durch die Behandlung mit Poloxamer 185-Dox-PBCA Nanopartikeln. Obwohl der Effekt der P-gp Inhibition in der Gegenwart von Poloxamer 185 höher war, zeigte Polysorbat 80 einen starken Effekt in der Zersetzung der Zellmembran, wodurch die Anzahl der lebenden Zellen stark vermindert werden konnte. Poloxamer 185 scheint hingegen einen direkten Einfluss auf die Funktionalität von P-gp auszuüben, wodurch es von großer Bedeutung für die Sensitivierung von resistenten Krebszellen sein könnte. Die Höhe der Poloxamer 185 Konzentration ist hierbei der entscheidende Parameter, um einen inhibitorischen Effekt auf den P-gp-vermittelten Transportmechanismus zu erzielen. Die Akkumulation von Rhodamin-123 (Rho-123), einem bekannten P-gp Substrat, konnte durch die Zugabe von 0,001 % bis 0,01 % stark erhöht werden, wobei ab einer Poloxamer 185 Konzentration von 0,1 % sich die Rho-123 Akkumulation signifikant reduzierte. Die maximale Rho-123 Akkumulation konnte bei einer Konzentration von 0,01 % Poloxamer 185 erreicht werden.