Open Access

Doris Popovic

• Molecular signaling networks, organized in discrete subsets of proteins in space and time, represent the major principle by which the cell achieves its functional specificity and homeostasis. Complex network organization is preserved by numerous mechanisms, including sequestration of proteins into specific subcellular compartments (eg. organelles), post-translational modifications and most importantly by balanced timing of their biosynthesis and turnover. Two routes of protein degradation, which are fundamentally quite different, are proteasomal and lysosomal-mediated destruction. The latter not only governs degradation of molecules that passed through endocytic or secretory process (trafficking from plasma membrane or Golgi compartment), but also the degradation of cytoplasmic molecules that have been sequestered by a process called macroautophagy (henceforth autophagy). Recently our understanding of autophagic regulatory mechanisms has increased significantly, as molecular details of how autophagy contributes to the degradation of proteins (old, misfolded or aggregated), damaged organelles or pathogens have been deciphered. Initially described as bulk, nonspecific membrane sequestration process induced primarily by nutrient deprivation, autophagy is now known to be selective in terms of cargo recognition and integration into dynamic cellular membrane trafficking system. My work has addressed the fundamental question of how small ubiquitin-like modifiers LC3/GABARAP, that are conjugated to the autophagic membranes, function within the process of cargo selection and crosstalk between autophagic and endocytic membrane trafficking events. We have employed an initial yeast twohybrid screen to identify LC3/GABARAP interacting partners. Using this technique, we have identified several novel autophagy receptor proteins, mitochondrial protein Nix (BNIP3L), and adaptor proteins, including Rab GTPase activating proteins (TBC family of proteins). Through a conserved LC3 interacting region (LIR), Nix, Rab GAPs and other autophagy adaptor/receptor molecules share a common mode of binding to LC3/GABARAP. However, in contrast to Nix, which specifically facilitates removal of mitochondria in maturing erythrocytes, Rab GAP proteins preferably regulate the dynamics of autophagosome formation and maturation as well as sorting of cargo. Fourteen out of 36 screened Rab GAPs interacted with LC3/GABARAPs. Importantly, identified Rab GAPs are clustered in different regulatory nodes according to the conservation of their GAP domain hence they impact various cellular membrane compartments and organelles, marked by specific subsets of small Rab GTPases. Identification of Rab GAPs that are directly involved in autophagy via binding to LC3 was the first report that clearly pointed to a broader implication of autophagy in all aspects of cellular membrane trafficking. Currently, only few of Rab GAPs are studied in context of autophagy regulation, while large number of them requires further functional characterization. I have identified two LIR motifs in TBC1D5, Rab7 GAP. LIR1 has also the ability to interact with retromer complex subunit, Vps29. Using several functional assays I have shown that this motif, as well as catalytic Arg within GAP domain are particularly important for function of TBC1D5 in retrograde transport of CI-M6PR from endosomes to the trans-Golgi network (TGN). I have also shown that TBC1D5 binds to LC3 and Vps29 in mutually exclusive way and that Thr at the position 1 and Phe at position 5 of LIR1 motif are both required for TBC1D5 interaction with Vps29. Upon autophagy induction TBC1D5 dissociates from retromer, and associates with autophagic vesicles, while silencing of TBC1D5 significantly impairs autophagic flux. These findings led to the hypothesis that LIR interacting surface on TBC1D5 acts as molecular switch for dual function of TBC1D5. This also indicated that similar surfaces for LIR interaction (similarly to ubiquitin-like domains) are present on proteins other than LC3, and pointed to a dual functionality of the LIR sequence within both endocytic and autophagic pathways. Following these initial studies, I have also shown that TBC1D5 interacts with AP2 complex subunit AP2M1, and that this interaction plays critical role in TBC1D5-dependent trafficking of Atg9. It is known that Atg9, the only trans-membrane autophagic protein, plays essential role in initiation of autophagy and growth of nascent phagophore membranes. However, machinery that specifically recruits Atg9 traffic carriers to the site of autophagosomes was not known. I subsequently demonstrated that TBC1D5 associates not only with LC3, but also with Atg9 traffic carriers and major initiatory kinase ULK1 during autophagy, while retromer failed to do so. Association of TBC1D5 with Atg9 was dependent on presence of AP2 complex, and on functional clathrin-mediated endocytosis (CME). Based on these and previous findings, model was proposed, that upon induction of autophagy TBC1D5 re-routes Atg9-containing clathrin vesicles from plasma membrane to the site of autophagosome. This led us to the better understanding of TBC1D5 function, but also to the first molecular cue that Atg9 traffics within clathrin-coated vesicles (CCVs). In fact, mutation of Leu-Leu motif within N terminus of Atg9, that potentially mediates interaction with adaptor protein complexes, led to enrichment of Atg9 on plasma membrane and in TGN. This suggested that the sorting motif could be important for interaction of Atg9 with AP2 and AP1 complex, as well. More importantly, TBC1D5 and Atg9 could be directly involved in dynamic regulation of growth factor receptor sorting during autophagy, thus explaining vital role of autophagy in organism development and pathogenesis. In summary, the work contained within my thesis provides data on the mechanism by which autophagy adaptor proteins participate in cargo selection and regulation of trafficking during autophagy. Firstly, the LIR motif can target proteins or organelles for autophagic degradation (eg. Nix). Secondly, specific LIR motifs can play essential function in recruiting membrane trafficking regulatory proteins that subsequently facilitate phagophore expansion (eg. TBC1D5). Thirdly, by means of reorganization of different protein assemblies (eg. TBC1D5-VPS29 vs. TBC1D5-LC3-Atg9), dynamics of membrane remodeling mediated by Rab GTPases is kept in control during autophagy, thus keeping the organelle integrity and balance within cellular lipid sources unaffected.
• Die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase ist für das Überleben einer Zelle von zentraler Bedeutung. Damit verbunden ist die Auftrennung der Proteine in subzelluläre Kompartimente, ihre post-translationale Modifizierung sowie eine zeitliche Regulierung der Biosynthese und des Proteinabbaus. Die Zelle verfügt über zwei zentrale Abbauwege für Proteine: Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) sowie das lysosomale System. Das Proteasom ist ein großer Proteinkomplex und zuständig für den Abbau zytosolischer Proteine mit einer kurzen Halbwertszeit sowie nicht-funktionieller oder fehlgefalteter Proteine. Proteine, die proteasomal abgebaut warden sollen, werden mit Ubiquitin markiert. Während das Proteasom jeweils nur ein Protein abbauen kann, sind die Lysosomen wesentlich flexibler in ihren Abbaukapazitäten. Lysosomen sind Organellen mit einer Einfachmembran, die unterschiedliche hydrolytische Enzyme enthalten und in der Lage sind, einzelne Proteine sowie große Proteinkomplexe, darunter auch das Proteasom oder Ribosomen, Proteinaggregate oder ganze Organellen (z. B. Mitochondrien und Peroxisomen) abzubauen. Beide Abbaumechanismen wirken zusammen, um den Umsatz von zellulären Bestandteilen zu regulieren. Hiermit beeinflussen sie Prozesse, wie DNA-Replikation, die Regulation des Zellzyklus, Zellteilung und – differenzierung und die Qualitätskontrolle von Proteinen, die allesamt essentiell sind für die Aufrechterhaltung der Zellfunktion. Es gibt zwei Wege, auf denen abzubauendes Material zu den Lysosomen geliefert wird: Der endozytotische Weg und die Autophagie (von griechisch auto-, "selbst" and phagein, "essen"). Extrazelluläres Material und Bestandteile der Plasmamembran, z.B. Wachstumsfaktor-Rezeptoren, werden mittels Endozytose zum Lysosom gebracht. Intrazelluläres Material hingegen, wie zytosolische Proteine, Proteinaggregate oder Zellorganellen, erreichen das Lysosom durch den Prozess der Autophagie. Dieser zeichnet sich durch die Bildung einer Doppelmembran aus, die zytosolisches Material umschließt und im Folgenden das Autophagosom bildet. Anschließend verschmilzt die äußere Membran des Autophagosoms mit dem Lysosom und das enthaltene Material wird enzymatisch abgebaut. Abbauprodukte wie Aminosäuren und Fette können dann durch die lysosomale Membran in das Zytosol transportiert werden und dienen dem Aufüllen des zellulären Vorräte. Das akute Auslösen von Autophagie (durch Nahrungsentzug oder Stress) führt zu einem dramatischen Anstieg der Zahl der Autophagosomen, weshalb man früher davon ausging, dass die Zelle unterschiedliche Mechanismen nutzt, um Membranen für die Bildung von Autophagosomen aus verschiedenen Quellen zu gewinnen. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass Autophagosomen zunächst von Membranen des endoplasmatischen Retikulums (ER) stammen und die Plasmamembran, Endosomen, der Golgi-Apparat sowie Mitochondrien erst später zu der Expansion der sich gebildeten Phagophore beitragen. Lange Zeit wurde die Autophagie für einen unspezifischen Abbauprozess gehalten, aber neueste Endeckungen haben gezeigt, dass Autophagie-Rezeptoren, die Ubiquitin-ähnliche Proteine (ubiquitin-like, UBL) aus der LC3/GABARAP-Familie (oder Atg8 in Hefe) binden, die Rekrutierung von abzubauendem Material an autophagosomale Membranen vermitteln. Die Bindungsstelle der Autophagie-Rezeptoren und –Adaptoren für LC3/GABARAP ist ein hochkonserviertes Tetrapeptid mit der Aminosäure-Abfolge [W/F/Y]xx[L/I/V], genannt LC3-interagierende Region (LIR). In meiner Arbeit beschäftige ich mich mit der Rolle von Ubiquitin-ähnlichen Proteinen in den Prozessen der Cargo-Selektion, sowie dem “crosstalk” von Endocytose und Autophagie in “membrane-trafficking events”. Zuerst bedienten wir uns des Hefe-zwei-Hybridsystems, um neue Interaktionspartner von LC3/GABARAP zu finden. Hierdurch identifizierten wir das mitochondriale Proteine Nix (BNIP3), ein Protein der äußeren mitochondrialen Membran, sowie mehrere RabGAP-Proteine die zur Familie der TBC-Domäne enthaltenden Proteine gehören. Bereits frühere Studien hatten gezeigt, dass beschädigte oder in zu großer Zahl vorhandene Mitochondrien durch Autophagie abgebaut werden, z. B. in der letzten Phase der Reifung von erythroiden Zellen. Der Auslöser für den Abbau von Mitochdrien ist die Depolarisation der äußeren mitochondrialen Membran und da dies noch vor der Aktivierung der Caspasen erfolgt, wirkt es auf diese Weise auch als interne Qualitätskontrolle von Mitochondrien. Während die Expression von Nix in der letzten Phase der eythroiden Differenzierung stark ansteigt, zeigen Nix knockout Mäuse Störungen in der Reifung von erythroiden Zellen, die zu mäßiger Anämie, Reticulozytose und erhöhter Erythropoese führen. Desweiteren induziert auch hypoxischer Stress die Expression von Nix. Wir konnten zeigen, dass Nix spezifisch durch sein mutmaßliches Nterminales LIR-Motiv an LC3/GABARAP bindet. Passend zu unserer Beobachtung, dass das Nix-LIR die höchste Affinität zu GABARAPL1 aufweist, konnten wir zeigen, dass GABARAPL1 zu pharmakologisch geschädigte Mitochondrien rekrutiert wird und dieser Mechanismus zum Teil von der Anwesenheit des LIR-Motifs in Nix abhängig ist. Da LC3/GABARAP-Proteine an die innere und äußere Membran von wachsenden Autophagosomen konjugiert werden und dort während der Vesikelreifung verbleiben, schlussfolgerten wir, dass Nix durch seine Bindung an GABARAPL1 Mitochondrien spezifisch für die Autophagie markiert. In der Tat konnten wir die Akkumulation von Mitchondrien in Retikulozyten aus Nix knockout Mäusen nur teilweise durch Wiedereinführung von Nix, das nicht mehr an GABARAPL1 binden konnten, rückgängig machen. Daraus folgerten wir, dass Nix als spezifischer Rezeptor für das selektive Entfernen von Mitochondrien während der Erythrozyten-Reifung wirkt. Interessanterweise wurde vor kurzem in zwei weiteren mitochondrialen Proteinen, dem Nix-Homolog BNIP3L und einem Protein der äußeren mitochondrialen Membran, FUNDC1, ein LIR-Motif entdeckt. In Übereinstimmung mit der Funktion von mitochondrialen Autophagierezeptoren, die direkt die Membranen der Autophagosomen rekrutieren, verändert die Phosphorylierung der LIR-Motive deren Affinität gegenüber LC3/GABARAP, wie es für Nix, BNIP3L und FUNDC1 gezeigt werden konnte. Desweiteren spielt die Ubiquitylierung von Proteinen der äußeren mitochondrialen Membran durch die E3-Ligase Parkin eine wichtige Rolle in deren selektivem Abbau. Die Beteiligung anderer mitochondrialer E3-Ligasen, die Proteine, die in diesem Zusammenhang ubiquityliert werden und die genauen Mechanismen der selektiven Mitophagie sind Gegenstand zukünftiger Forschungsarbeiten. Neben der Charakterisierung von Nix überprüfte ich die 36 RabGAP-Proteine aus der TBC Proteinfamilie auf eine Bindung zu LC3/GABARAP. In GST-Pulldown-Experimenten mit aufgereinigten LC3/GABARAP-Proteinen konnte ich 14 RabGAPs identifizieren, die LC3/GABARAP binden und die sich in einem phylogenetischen Baum, geordnet nach Konserviertheitsgraden ihrer GAP-Domänen, in unterschiedliche Gruppen einteilen ließen. Diese Entdeckungen legten nahe, dass “crosstalk” von Autophagie und Vesikeltrafficking an allen zellulären Kompartimenten stattfinden, die von den unterschiedlichen RabGTPasen reguliert werden. Zusätzlich habe ich zwei mutmaßliche LIR-Motive im Rab7-GAP TBC1D5 sowie jeweils ein LIR in TBC1D25 und TBC1D2B identifiziert. Durch initiale Massenspektrometrie-Experimente entdeckte ich den Retromer-Komplex als neuen Interaktionspartner von TBC1D5. Es stellte sich heraus, dass das N-terminale LIRMotiv in TBC1D5 auch für die Bindung zur Retromer-Komplex-Untereinheit Vps29 benötigt wird. Weder die katalytisch inaktive noch die LIR1-defiziente Mutante von TBC1D5 konnte die Störungen im retrograden Transport des Mannose-6-Phospat-Rezeptors (M6PR) im Vergleich zum Wildtyp von TBC1D5 retten. Außerdem konnten wir zeigen, dass die Bindung von TBC1D5 an LC3 die Interaktion von TBC1D5 mit Vps29 ausschließt. Die Induktion der Autophagie führt zur Dissoziation von TBC1D5 aus dem Retromer-Komplex und zu Assoziation von TBC1D5 mit Autophagosomen. Daraus schließe ich, dass TBC1D5 die Dynamik des retrograden Transports während der Autophagie durch Assoziation und Dissoziation mit dem Retromer-Komplex und anschließender Regulation von Rab7 moduliert. Interessanterweise war für das Protein Atg9, das für die Bildung von Autophagosomen benötigt wird, bereits gezeigt worden, dass dieses innerhalb des Trans-Golgi-Netzwerks (TGN) und der Endosomen zirkuliert, und mit Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren und dem Retromer-Komplex in gleichen Zellfraktionen nachweisbar ist. Obwohl es notwendig ist, dass Atg9 zur Bildungsstelle der Phagophoren rekrutiert wird, ist die dafür notwendige Maschinerie bisher unbekannt. Ich beobachtete, dass der Verlust von TBC1D5 die Lipidierung von LC3 signifikant beinflusste und zu einer Reduzierung von Atg9-Punkten führte. Auch wurde bei Induktion der Autophagie in Zellen, denen es an TBC1D5 mangelte, mehr Atg9-Protein zu späten Endosomen gebracht. Aktuelle Studien regten an, dass sich Atg9 in kleinen, dynamischen Vesikeln befindet, die möglicherweise von Clathrin umhüllt sein und von der Plasmamembran und dem TGN abstammen könnten. Passend zu dieser Hypothese konnten wir im Interaktom von TBC1D5 zwei Untereinheiten des AP2-Komplexes identifizieren. Dieses Ergebnis stimmt mit einem Bericht aus dem Jahr 2006 überein, in dem TBC1D5 die Untereinheit AP2M1 in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Experiment bindet. In der Tat konnte ich zeigen, dass sowohl TBC1D5 als auch Atg9 an den AP2-Komplex binden. Darüber hinaus dissoziieren TBC1D5 und Atg9 nach Induktion der Autophagie vom Retromer-Komplex und binden einander. Hemmung der Clathrin-abhängigen Endozytose durch Inhibitoren verstärkte die Interaktion zwischen Atg9 und TBC1D5 während die Depletion von AP2 deren Wechselwirkung verhinderte. Diese Beobachtungen deuteten an, dass Atg9 von der Plasmamembran AP2-abhängig transportiert wird und Signale übermittelt. Daraus schloss ich, dass TBC1D5 die Atg9-AP2-Vesikel nach Autophagie-Induktion zu den Phagophoren umleitet und auf diese Weise die Expansion der Membran ermöglicht. Interessanterweise wurde bereits berichtet, dass die Plasmamembran über die Interaktion von AP2 mit Atg16 als Quelle für die Bildung von Autophagosomen dienen kann. Die gleiche Forschungsgruppe zeigte vor kurzem ebenfalls, dass Atg9 von der Plasmamembran Signale weiterleitet, wenn auch in anderen Versikeln als Atg16. Beide Proteinvesikel würden sich dann im Stadium des “recycling” Endosoms vereinigen. Da ich keine Kolokalisation von TBC1D5 mit Atg16 detektieren konnte, vermute ich, dass TBC1D5 sehr früh in der Bildung von Clathrin-umhüllten Vesikeln wirkt. Der zu Grunde liegende Mechanismus bedarf jedoch noch weiterer Studien. Von großer Bedeutung könnte jedoch sein, dass die Funktion von TBC1D5 in AP2-abhängiger Endozytose einen generellen Mechanismus darstellen könnten, mit dem Wachstumsfaktorrezeptoren während der Autophagie reguliert oder sortiert werden. Des Weiteren assoziierte TBC1D5 auch mit aktiver ULK1-Kinase, der bedeutendsten Kinase in der Initiation von Autophagie. Mit Hilfe eines SILACbasierten proteomischen Ansatzes identifizierte ich Phosphorylierungsstellen in TBC1D5, die möglichweise die Dissoziation von TBC1D5 vom Retromer-Komplex regulieren könnten. Die Sequenzanalyse von Atg9 offenbarte ein Di-Leucin-Motiv im Nterminalen zytosolischen Bereich von Atg9, das für die Internalisierung und die Sekretion von Atg9 notwendig ist und andeutete, dass Atg9 möglicherweise auch den AP1-Komplex binden könnte. Hinzukommend führte die Depletion von AP1 in Zellen zu einer Blockade in der Verteilung von Atg9 nach der Induktion der Autophagie. Dies ließ die Vermutung zu, dass TBC1D5, Atg9 und Adaptorkomplexe durch die Regulation von Endozytose und Sekretion direkt den Prozess der Autophagie modulieren können. Zusammenfassend konnte ich in meiner Arbeit sowohl Autophagozytose-Rezeptoren (NIX) als auch Autophagozytose-Adapter (Rab-GAPs) identifizieren, deren Funktion auf ihrer Interaktion mit dem Ubiquitin-ähnlichem Modifikator LC3/GABARAP bzw. ihrem LIR Motiv basiert. Während NIX eine wichtige Rolle in der Mitophagie zugewiesen werden konnte, wurde die Funktion der Rab-GAPs exemplarisch an dem Rab7-GAP TBC1D5 aufgezeigt: Das LIR1 Motiv von TBC1D5 dient als molekularer Schalter, der nach einer Induktion der Autophagozytose eine weitreichende Reorganisation des Membrantransports einleitet und damit auch die Zusammensetzung von integralen und peripheren Membranproteinen stark beeinflusst. Diese Reorganisation betrifft sowohl die Endozytose als auch die Autophagozytose und liefert erste Hinweise auf eine umfangreiche Vernetzung zwischen diesen bisher nur getrennt betrachteten Systemen.