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Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Dynamische Proteininteraktionen sind die Grundlage biologischer Prozesse, ihr korrekter Ablauf ist essentiell für die intakte Physiologie aller Organismen. Die Aufklärung der Struktur und Funktion von Proteinen inklusive ihrer komplexen Interaktionen, ist entscheidend für das Verständnis biologischer Prozesse. Methoden zur Untersuchung von Protein-Interaktionen sind in der Regel auf die Modifikation von Proteinen angewiesen. Zum Einen ist die selektive Markierung von Proteinen mit spektroskopischen Sonden – insbesondere mit Fluorophoren – ein wichtiger Ansatz zur in vivo und in vitro Interaktionsanalyse. Zum Anderen gewinnen festphasenbasierte Analysemethoden zunehmend an Bedeutung. Multivalente Chelatoren (MCH) bieten vielseitige Möglichkeiten, rekombinante Proteine reversibel an spektroskopische Sonden oder Oberflächen anzubinden und haben dadurch ein enormes Potential für Anwendungen zur funktionalen Charakterisierung von Proteinen. Ziel dieser Arbeit war es, die Energetik und Dynamik der Interaktion von MCH mit Oligohistidinen zu charakterisieren, um diese insbesondere zur Organisation von Proteinen in Mikro- und Nanostrukturen einzusetzen. Die Interaktion der MCH mit Histidin-Tags unterschiedlicher Länge und Sequenz wurde in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Es zeigte sich, dass die zunehmende Länge und die Redundanz auf Seiten des Histidin-Tags in einer erhöhten Affinität resultierten. Das Einführen einzelner Spacer-Aminosäuren resultierte hingegen in einer drastischen Reduktion der Komplexstabilität. Ein Alanin-Scanning zeigte, dass vor allem die zentralen Histidine besonders wichtig für eine stabile Bindung sind. Dieser Effekt lässt sich dadurch erklären, dass es sich bei der MCH-Oligohistidin-Interaktion um einen äußerst dynamischen Prozess handelt, bei dem die Metallkoordinationsstellen mit ständig wechselnden Histidinen interagieren. Diese Permutation erhöht die Entropie des Komplexes, und ist somit Grund für die erhöhte Affinität mit steigender Redundanz des Histidin-Tags. Anhand von Chelator-Dichte-Arrays konnte gezeigt werden, dass die Stabilität der Bindung von Histidin-getagten Proteinen nicht nur mit der Multivalenz der Chelatoren, sondern auch mit der MCH-Dichte ansteigt. In Kompetitionsexperimenten mit Hexa- und Dekahistidinen auf den MCH-Dichte-Arrays wurden veränderte Stabilitäten beobachtet. Die Stabilität von H6 ver5. veringert sich in Anwesenheit von H10, wobei sich die scheinbare Affinität von H10 in Anwesenheit von H6 erhöht. Dies wird auf die gleichzeitige Interaktion mit verschiedenen MCH-Molekülen auf der Oberfläche, die Oberflächenmultivalenz, zurückgeführt. Um diesen Effekt anhand von MCHMolekülen mit definiertem Abstand zu untersuchen, wurde ein Tris-NTABiotin-Konjugat (BTTris-NTA) hergestellt und auf Streptavidin-Oberflächen bzw. fluoreszenzmarkiertem Streptavidin eingesetzt. Echtzeit TIRFS-RIf-Kompetitionsexperimente zeigten eine veränderte Bindungskinetik für H6 in Anwesenheit von H10, welche darauf zurückzuführen ist, dass H6 aktiv durch H10 verdrängt wird. Dieser Effekt ist offenbar auf die dynamische Interaktion des Oligohistidins mit multiplen Chelatoren auf der Oberfläche zurückzuführen, welche den aktiven Austausch von H6 gegen H10 ermöglicht. Sowohl auf Oberflächen als auch in Lösung wurden für die Interaktion von Streptavidin-gebundenem BTTris-NTA mit Oligohistidinen um Faktor 3-5 erhöhte Affinitäten, im Vergleich zu freiem Tris-NTA, festgestellt. Interaktionsanalysen in Lösung zeigten maximale Komplex-Stöchiometrien von 1:2 für die Interaktion von Streptavidin-BTTris-NTA mit Oligohistidinen. Diese Stöchiometrien sowie die erhöhte Affinität lassen sich durch die gleichzeitige Interaktion von zwei benachbarten an Streptavidin gebundenen BTTris-NTA-Molekülen mit einem Oligohistidin erklären. Die räumliche Nähe der Tris-NTA-Moleküle erhöht die Redundanz auf Seiten des Chelators, was sich wiederum positiv auf die Entropie auswirkt und damit zu einer erhöhten Affinität führt. Diese Ergebnisse bestätigen den postulierten Effekt der Oberflächenmultivalenz. Es wurde gezeigt, dass BTTris-NTA die reversible Biotinylierung Histidingetagter Proteine ermöglicht, und damit eine Brücke zwischen den zwei am meisten eingesetzten Werkzeugen der Biochemie, dem Histidin-Tag und dem Biotin-(Strept)Avidin-System, schlägt. BTTris-NTA findet in verschiedenen Bereichen Anwendung: zur Umwandlung kommerzieller (Strept)Avidin-Oberflächen in Tris-NTA-Oberflächen, in Phage-Display-Screenings und Western Blot Analysen sowie zur Markierung von Rezeptoren auf Zelloberflächen. Die Biotinylierung über BTTris-NTA ermöglicht es zudem, auch Proteine geringer Konzentrationen (<10 nM) effizient auf Streptavidinoberflächen zu immobilisieren. Diese Selbstassemblierung Histidin-getagter Proteine wurde zur Organisation von Proteinen auf Oberflächen in Mikro- bis Nanometer-Dimensionen genutzt.
Protein-protein interactions within the plane of cellular membranes play a key role for many biological processes and in particular for transmembrane signaling. A prominent example is the ligand-induced crosslinking of cytokine receptors, where 3- dimensional cytokine binding followed by 2-dimensional interaction between the receptor subunits have been recognized to be important for regulating signaling specificity. The fundamental importance of such coupled interactions for cell-surface receptor activation has stimulated numerous theoretical studies, which have hardly been confirmed experimentally. An experimental approach to measure interactions and real time kinetics of type I interferon (IFN) induced assembly between interferon receptor subunits ifnar2 and ifnar1 on membrane was developed and determinants of the 2-dimensional interactions, such as dimensionality, size, valency, orientation, membrane fluidity and receptor density were quantitatively addressed The C-terminal decahistidine tagged extracellular domains (EC) of ifnar1 and ifnar2 were site- specifically tethered onto solid-supported fluid lipid membrane, which carried covalently attached chelator bis-nitrilotriacetic acid (bis-NTA) groups. Interactions on the lipid bilayer were detected with a novel solid phase detection technique, which allows simultaneous detection of ligand binding to a membrane anchored receptors and lateral interaction between them in the real time. This was achieved by combining two optical techniques: label-free reflectance interferometry (RIf) and total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). Fluorescence signals, in the order of 10 fluorophores/µm2, were detected without substantial photobleaching. The sensitivity of the label-free interferometric detection was in the range of 10 pg/mm2. The crosstalk between the two signals was eliminated by means of spectral separation. Fluorescence was detected in the visible region and RIf was performed at 800 nm in the near infrared. Flow through conditions allowed to automate experiments and measure binding events as fast as ~ 5 s-1. Using this technique we have dissected the interactions involved in IFN-induced ifnar crosslinking. 2-dimensional association and dissociation rate constants were independently determined by tethering high stoichiometric excess of one of the receptor subunits and comparing dissociation of the labelled ligand away from the membrane in the absence and presence of the non-labelled high affinity competitor. Dissociation traces were fitted with the two-step dissociation model: the first step being the 2-dimensional separation of the ternary complex followed by the 3- dimensional ligand dissociation into solution. Label-free RIf detection allowed absolute parameterization of the 2-dimensional concentrations of the ifnar subunits on the membrane. The TIRFS signal provided high sensitivity of the ligand dissociation and was correlated against the RIf signal before fitting. These features of the detection system allowed us to parameterize the model, and the 2-dimensional association or dissociation rate constants were the only variables during the fitting. Another FRET based binding assay was developed to determine the 2- dimensional dissociation rate constant using a pulse-chase approach. The donor fluorescence from ifnar2-EC was quenched upon the ternary complex formation with the acceptor-labelled IFN and the nonlabelled ifnar1-EC. The equilibrium was perturbed by rapid tethering of substantial excess of the nonlabelled ifnar2-EC onto the membrane. The exchange of the labelled ifnar2-EC with the nonlabelled one was monitored as the decrease in the FRET signal with the 2-dimensional dissociation of ifnar2-EC from the ternary complex being the rate limiting step. Based on the several mutants and variants of the interacting proteins, the effect of different rate constants and receptor orientation on the 2-dimensional crosslinking dynamics was studied. We have identified several critical features of the 2- dimensional interactions on membranes, which cannot be readily concluded from the solution binding assays. The restricted rotation and the increased lifetime of the encounter complex due to high membrane viscosity are the main determinants of the 2-dimensional association. Tethering ifnar1-EC to the membrane via N-terminal decahistidine tag decreased the 2-dimensional association rate constant 4-5 fold. Electrostatic attraction and steering, the important mechanism to enhance association rate constant between the soluble proteins, are not pronounced for interactions on the membrane. Protein orientation due to membrane anchoring dominates over electrostatic effects and together with the increased lifetime of the encounter complex consequence that 2-dimensional association rate constants are quite similar and do not correlate with association rate constants in solution. The 2- dimensional dissociation rate constants were generally 2-5-fold lower compared to the corresponding 3-dimensional dissociation rate constants in solution. Possible explanations for this are that long lifetime of the encounter complex stabilizes the ternary complex or that membrane tethering affects the interaction diagram. In conclusion, combined TIRFS-RIf detection turn to be powerful and versatile technique to characterize protein-protein interactions on membranes.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Biophysical investigation of the ligand-induced assembling of the human type I interferon receptor
(2005)
Type I interferons (IFNs) elicit antiviral, antiproliferative and immunmodulatory responses through binding to a shared receptor consisting of the transmembrane proteins ifnar1 and ifnar2. Differential signaling by different interferons – in particular IFNalpha´s and IFNbeta – suggest different modes of receptor engagement. In this work either single ligand-receptor interactions or the formation of the extracellular part of a signaling complex were investigated referring to thermodynamics, kinetics, stoichiometry and structural organization. Initially an expression and purification strategy for the extracellular domain of ifnar1 (ifnar1-EC) using Sf9 insect cells yielding in mg amounts of glycosylated protein was established. Using reflectometric interference spectroscopy (RIfS) the interactions between IFNalpha2/beta and ifnar1-EC and ifnar2-EC was studied in order to understand the individual energetic contributions within the ternary complex. For IFNalpha2 a Kd of 5 µM for the interaction with ifnar1-EC was determined. Substantially tighter binding of IFNbeta with both ifnar2-EC and ifnar1-EC compared to IFNalpha2 was observed. For neither IFNalpha2 nor IFNbeta stabilization of the complex with ifnar1-EC in presence of soluble ifnar2-EC was detectable. In addition, no direct interaction between ifnar2 and ifnar1 was could be shown. Thus, stem-stem interactions between the extracellular domains of ifnar1 and ifnar2 do not seem to play a role for ternary complex formation. Furthermore, ligand-induced cross-talk between ifnar1-EC and ifnar2-EC being tethered onto solid-supported, fluid lipid bilayers was investigated by RIfS and total internal reflection fluorescence spectroscopy. A very stable binding of IFNalpha2 at high receptor surface concentrations was observed with an apparent kd approximately 200-times lower than for ifnar2-EC alone. This apparent kd was strongly dependent on the surface concentration of the receptor components, suggesting kinetic rather than static stabilization, which was corroborated by competition experiments. These results indicate that signaling is activated by transient cross-talk between ifnar1 and ifnar2, which is by several orders of magnitude more efficiently engaged by IFNbeta than by IFNalpha2. With respect to differential recognition of different IFNs ifnar1-EC was dissected into sub-fragments containing different of the four Ig-like domains. The appropriate folding and glycosylation of these proteins, also purified in mg amounts were confirmed by SDS-PAGE, size exclusion chromatography and CD-spectroscopy. Surprisingly, only one construct containing all three N-terminal Ig-like domains was active in terms of ligand binding, indicating that these domains were required. Competitive binding of IFNalpha2 and IFNbeta to both this fragment and ifnar1-EC was demonstrated. Cellular binding assays with different fragments, however, highlight the key role of the membrane-proximal Ig-like domain for the formation of an in situ IFN-receptor complex and the ensuing signal activation. Even substitution with Ig-like domains from homologous cytokine receptors did not restore high-affinity ligand binding. Receptor assembling analysis on supported lipid bilayer revealed that appropriate orientation of the receptor is required, which is controlled by the membrane-proximal Ig-domain. All results indicate that differential signalling is encoded by the efficiency of signalling complex formation, which is controlled by the binding affinity of IFNs to the extracellular domains of ifnar1 and 2.
Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN
(2006)
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.