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Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu analysieren, welche Einflussgrößen sich auf die Kryotransferergebnisse positiv oder negativ auswirken können, um somit Paaren, die über kryokonservierte Zellen verfügen, am effektivsten zu einem gemeinsamen Kind zu verhelfen.
Untersucht wurde, ob das Alter der Patientinnen, die Art der Befruchtung, die Anzahl der übertragenen Embryonen und die Zyklusvorbereitung einen Unterschied auf die Entwicklungs- und Implantationsfähigkeit menschlicher Eizellen sowie auf die Schwangerschaftsrate nach Kryokonservierung und Auftauen im Pronucleus-Stadium aufwiesen.
In der vorliegenden Studie wurden 126 Patientinnen mit ungewollter Kinderlosigkeit, die zwischen 2002 und 2004 am Universitätsklinikum Frankfurt am Main in Behandlung waren, aufgenommen. Das Durchschnittsalter der Patientinnen lag bei 33,3 Jahren. Von 226 durchgeführten Kryotransferzyklen resultierten die Pronukleus-Eizellen bei 34 Kryotransferzyklen aus einer In-vitro-Fertilisation (IVF) und bei 192 Zyklen aus einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI).
Es wurde festgestellt, dass in der vorliegenden Studie die erzielte Erfolgsrate, gemessen an der relativ geringen Schwangerschaftsrate, deutlich niedriger lag als beim deutschen IVF-Register. Das Resultat muss jedoch auch unter dem Aspekt der schlechten Ergebnisse der IVF-/ICSI-Therapie in der untersuchten Gruppe betrachtet werden.
Die Ergebnisse der Kryotherapie sind dagegen mit den Zahlen anderer Reproduktionszentren vergleichbar, die derzeit eine Effektivität von durchschnittlich 19,12 % erreichen (DIR 2007) (23).
Bei der Untersuchung wurde jeweils nur der erste und zweite Kryotransferzyklus pro Patientin ausgewertet, damit die Voraussetzung zur Untersuchung der Einflüsse anamnestischer Faktoren gleich war.
Durch ICSI befruchtete Eizellen führten nach Kryokonservierung seltener zu einer Schwangerschaft (11,59%) als nach IVF (16,66%), beim Primärtransfer war das Ergebnis weniger verschieden (9,41% und 7,40%).
Die Vorbereitung des Kryotransferzylus war insofern relevant, als das der Transfer im spontanen Zyklus bezüglich der Schwangerschaftsrate am erfolgreichsten war (13,79%). Der Transfer in einem artifiziellen Zyklus, also nach Stimulation aus einer Kombination von HMG mit FSH, der alleinigen Verabreichung beider Medikamente oder nach dem Kaufmann-Schema, erbrachte dagegen nur eine geringe Schwangerschaftsrate von 6,45%.
Signifikante Unterschiede wiesen die im Punktionszyklus verwendeten Medikamente zur ovariellen Stimulation hinsichtlich der Degenerationsrate nach dem Auftauen der PN-Stadien auf, die nach HMG-Stimulation niedriger (19,35%) als nach FSH-Stimulation (30,82%) war, die Schwangerschaftsrate wies allerdings keine deutlichen Unterschiede auf (11,90% und 13,08%).
Das Alter der Patientinnen hatte wider Erwarten in der vorliegenden Untersuchung keinen eindeutigen Einfluss auf die Schwangerschaftsrate.
Die Resultate bestätigten, dass ein Transfer von maximal drei erlaubten Embryonen die besten Ergebnisse erzielte (19,6 %), hingegen bei einem Transfer von zwei Embryonen ein Ergebnis von nur 5,5 % vorlag. Dieses Ergebnis spricht, wie bereits bei anderen Forschungsergebnissen postuliert, für einen Transfer von drei Embryonen und sollte somit angestrebt werden.
Es lässt sich zusammenfassen, dass die Ergebnisse der Kryotransferbehandlungen in Bezug auf die untersuchten Parameter, wie spontan/hormonelle Kryotransferzyklen, IVF- oder ICSI- Behandlung und Alter, nur geringe Unterschiede aufwiesen.
Einen signifikanten Einfluss auf die Erfolgsrate hatten jedoch die Anzahl der transferierten Embryonen und die verschiedenen Stimulationsmedikamente auf die Degeneration der Oozyten.
Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass die Kryokonservierung die Effizienz der reproduktionsmedizinischen Behandlung nachweislich erhöht. Darüber hinaus plädiert sie für ein Überdenken des deutschen Embryonenschutzgesetzes, um somit den Frauen eine hohe Anzahl von Behandlungszyklen zu ersparen.
Die Entwicklung Philadelphia Chromosom-positiver (Ph+) chronischer myeloischer und
akuter lymphatischer Leukämie (CML und ALL) ist auf das Verschmelzen von ABL-und
BCR-Gensequenzen zurückzuführen. Die Bildung dieses BCR/ABL-Fusionsprotein führt
zu einer konstitutiv gesteigerten ABL-Tyrosinkinase-Aktivität mit der Folge einer
Deregulierung vielfältiger intrazellulärer Signalwege und der Induktion des
leukämischen Phänotyps.
Eine zielgerichtete Inhibierung von BCR/ABL mit Hilfe von ABL-Kinase-Inhibitoren
induziert Apoptose in BCR/ABL-transformierten Zellen und hat eine komplette
hämatopoetische Remission in Ph+ Leukämie-Patienten in der chronischen Phase zur
Folge. Eine große Zahl an Patienten mit fortgeschrittener Ph+ Leukämie erleidet
allerdings einen Rückfall und entwickelt Resistenzen gegen die molekularen
Therapeutika. Ein Hauptgrund für die Resistenzentwicklung sind Punktmutationen im
Bereich der ABL-Tyrosinkinase.
Die Punktmutation T315I ist als einzige Mutation gegen alle bisher entwickelten
Medikamente resistent. Sie ist auf eine Punktmutation von Threonin zu Isoleucin an
einer äußerst kritischen Stelle, der so genannten „Gatekeeper-Position“
zurückzuführen. Die T315I scheint nicht nur die Bindungsaffinität der Kinase-
Inhibitoren zu verhindern, sondern erzeugt zusätzliche Eigenschaften, die das
leukämogene Potential von BCR/ABL verstärken.
Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war es daher, den Einfluss der T315I auf das
transformatorische Potential von BCR/ABL aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass
die T315I sowohl bei p185BCR/ABL, als auch bei p210BCR/ABL zu einem gesteigerten und
Faktor-unabhängigen Wachstum führt. Zudem wurde im Rahmen einer Struktur-
Funktionsanalyse verdeutlicht, dass die T315I unabhängig von BCR-Sequenzen in der
Lage ist, Faktor-unabhängiges Zellwachstum in 32D- und Ba/F3-Zellen, aber nicht
klassisches Transformationspotential in Fibroblasten zu vermitteln.
106
Ebenfalls war Gegenstand der experimentellen Arbeiten die Untersuchung, ob die
durch die T315I-vermittelte Resistenz gegenüber der Hemmung der Oligomerisierung
durch kompetitive Peptide von der Präsenz von BCR-Funktionsdomänen abhängt,
welche für die Aktivierung der Ras-Signalwege unerlässlich sind.
Es konnte nachgewiesen werden, dass die T315I-Punktmutation nur dann Resistenz
gegenüber der Hemmung der Oligomerisierung induziert, wenn BCR-Sequenzen als
Ausgangspunkt für den Ras-Signalweg (Tyr 177), in den verwendeten Konstrukten
vorhanden sind. Fehlen BCR-Sequenzen, so hemmen die kompetitiven Peptide auch
T315I-positive BCR/ABL-Deletionsmutanten.
Darüber hinaus wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, neue Lösungsansätze in der
Grundlagenforschung aufzuzeigen, indem ein neuartiges Zellkultursystem mit drei BALL-
Patienten-abgeleiteten Langzeitkulturen (PDLTCs) angewendet wurde. Die CMPDLTC
trägt unmutiertes BCR/ABL, während die KÖ-PDLTC BCR/ABL-T315I positiv ist.
Als dritte PDLTC stand die CR als BCR/ABL-negative Zellkultur zur Verfügung.
Zum ersten Mal war es mit Hilfe dieses relevanten Zellmodells möglich, die
inhibitorische Wirkung des Helix-2-Peptids in primären ALL-PDLTCs zu überprüfen.
Es konnten die bisherigen Ergebnisse aus den murinen Zelllinien zur Wirkung der
Hemmung der Oligomerisierung bestätigt werden, da auch in diesem Modell die Zellen
mit T315I-BCR/ABL resistent gegenüber den kompetitiven Peptiden waren.
Zusammenfassend lassen die Daten dieser wissenschaftlichen Arbeit die
Schlussfolgerung zu, dass die Punktmutation T315I nicht zum Schwerpunkt in der
Erforschung weiterer molekularer Therapeutika erklärt werden sollte. Vielmehr scheint
es in naher Zukunft von äußerster Bedeutung zu sein, besonders die Kaskade der
aberranten Signaltransduktionswegen mit dem Ausgangspunkt in wesentlichen BCRFunktionsdomänen
zu inhibieren.
Außerdem stellen die primären Patienten-abgeleiteten Langzeitkulturen eine
Möglichkeit dar, die Wirkung neuer molekularer Therapeutika effektiv zu überprüfen
und die Pathogenese von Ph+ Leukämien noch besser zu verstehen.
Suchtverhalten wird zu wesentlichen Anteilen durch die mesolimbische, dopaminerge Signalweiterleitung vermittelt. Daher wurde der gesamte DRD2-Genlokus und ergänzend der ANKK1 rs1800497C>TEinzelnukleotid Polymorphismus (SNP), der früher als „Dopamin D2 Rezeptor Taq1A C>T Polymorphismus“ bezeichnet wurde, auf Assoziationen mit dem Risiko, an einer Opiatabhängigkeit zu erkranken, und dem Methadondosisbedarf einer Methadonsubstitutionstherapie untersucht.
Die Allelfrequenzen der DRD2/ANKK1-Polymorphismen wurden zwischen 85 methadonsubstituierten, kaukasischstämmigen Patienten und 99 zufällig ausgewählten, gesunden kaukasischstämmigen Kontrollen verglichen. Innerhalb der Patientengruppe wurde untersucht, ob die tägliche Methadondurchschnitts- bzw. -höchstdosis im ersten Jahr der Behandlung und die Zeit, bis die Höchstdosis erreicht wurde, mit genetischen Varianten der Gene für DRD2 und ANKK1 assoziiert werden kann.
Verglichen mit der Kontrollgruppe findet sich bei Drogenabhängigen das minor-Allel des DRD2 rs1076560G>T-SNPs (p=0.022, Odds Ratio 2.343) oder der ATCT-Haplotyp des DRD2 rs1799978A>G, rs1076560G>T, rs6277C>T, ANKK1 rs1800497C>T häufiger (p=0.048, Odds Ratio 2.23). Ähnliche Tendenzen zeigen sich für ANKK1 rs1800497C>T (p=0.056, Odds Ratio 2.12) und den TCCTCTT-Haplotyp des DRD2-Rezeptors, der sich aus rs12364283T>C, rs1799732Cdel, rs4648317C>T, rs1076560G>T, rs6275C>T, rs6277C>T und ANKK1 rs1800497C>T zusammensetzt (p= 0.059, Odds Ratio 2.31). Die Methadondurchschnitts– und -höchstdosierungen ließen sich signifikant mit dem DRD2 rs6275C>TSNP assoziieren (p=0.016 für die Durchschnittsdosis und p=0.005 für die Höchstdosis). Träger des rs6275T-Allels benötigten höhere Methadondosierungen als Patienten, die dieses Allel nicht tragen. Zusätzlich wurde diese genetische Variante mit einer längeren Zeitperiode bis zum Erreichen der Methadonhöchstdosis assoziiert (p=0.025).
Zusammenfassend wurde in dieser Dissertationsarbeit der gesamte Genlokus des DRD2-Rezeptors von der Promotorregion bis hin zum ANKK1 rs1800497C>T-Polymorphismus analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Polymorphismen, die den DRD2-Rezeptor betreffen, das Risiko, an einer Opiatabhängigkeit zu erkranken, entscheidend beeinflussen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Dosisbedarf zur erfolgreichen Aufrechterhaltung einer Methadonsubstitutionstherapie durch diese Polymorphismen beeinflusst wird.
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie
(2010)
Bei chronischen Erkrankungen ist eine regelmäßige Arzneimitteleinnahme eine der Vo-raussetzungen für den Therapieerfolg. Trotzdem nehmen viele Patienten ihre Arzneimit-tel nicht wie vorgeschrieben ein. Dies kann im Rahmen von kardiovaskulären Erkrankun-gen (z. B. Hypertonie) schwerwiegende Folgen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall haben. Es ist bekannt, dass die Therapietreue (Adhärenz bzw. Compliance und Persistenz) bei Hypertonikern nur bei 30 – 55 % liegt. Daher ist es von größter Wichtigkeit, die Therapie-treue und die Gründe für mangelnde Adhärenz zu erfassen, um danach gezielte Interven-tionen zur Verbesserung dieser entwickeln zu können. Allerdings liegen aus Deutschland zu dieser Thematik nur wenige Untersuchungen aus Feldstudien in Apotheken oder Ana-lysen aus Verordnungsdatenbanken vor.
Um die zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Ermittlung der Therapietreue großflä-chig abzudecken, wurden unterschiedliche Erfassungswege genutzt. Zum einen wurde eine Patientenbefragung in öffentlichen Apotheken zur Erfassung der Adhärenz und Ein-nahmegewohnheiten unter medikamentöser Therapie mit Antihypertensiva durchge-führt. Zum anderen diente die Analyse von Verordnungsdaten der DAPI-Datenbank dazu, die Persistenz und Compliance von Patienten unter antihypertensiver Therapie zu be-stimmen. Als Spezialfall wurde weiterhin betrachtet, ob die Umstellung von einem Origi-nal- auf ein generisches Ramipril-Präparat nach dessen Patentauslauf mit einer vermin-derten Compliance einhergeht.
Die Patientenbefragung wurde sowohl von Patienten wie auch von den 24 teilnehmenden Apotheken gut angenommen. Dies zeigen die Rücklaufquoten der ausgegebenen Frage-bögen (46,8 % für die Befragung per zugesandtem Fragebogen (KF; kurze Form des Frage-bogens) und 32,8 % für das Interview in der Apotheke (LF; lange Form des Fragebogens)) Gemessen anhand des eingesetzten Adhärenz-Scores beschrieben sich 71,9 % der Patien-ten im LF und 58,2 % im KF selbst als adhärent. Der Bedarf für strukturierte, einfach durchführbare Adhärenz-Erfassungsinstrumente für die öffentliche Apotheke wurde sehr deutlich, wie u. a. der Abschlussbericht, welcher von den Apotheken nach Abschluss der Befragung ausgefüllt wurde, zeigte. Demnach hielten die Apotheken die Befragung von Umfang und Verständlichkeit für angemessen. Die Patienten waren bereit, detaillierte
Kapitel V Zusammenfassung V
Dissertation Miriam Ude
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie 160
Auskünfte über ihre Erkrankung zu geben. Dies zeigten auch die vielen in den Bogen ein-getragenen Anmerkungen seitens der Patienten und Apothekern, in denen individuelle Probleme dokumentiert wurden.
Bei der Analyse von Persistenz und Compliance im Substanzklassenvergleich wurde ein-drücklich gezeigt, dass die Therapietreue unter den First-line-Antihypertensiva (AHT) sub-optimal ist. Patienten unter der Therapie mit β-Blockern (77,3 %) weisen den geringsten non-persistenten Anteil auf, gefolgt von Patienten mit Verordnungen über ACE-Hemmer (78,7 %), AT1-Antagonisten (79,0 %), Calcium-Kanal-Blocker (81,4 %) und Diuretika (83,0 %). Hinsichtlich der Compliance findet sich in der Gruppe der mit AT1-Antagonisten be-handelten Patienten der niedrigste Anteil mit Non-Compliance (52,1 %), gefolgt von ACE-Hemmern (54,1 %), β-Blockern (54,7 %), Calcium-Kanal-Blockern (58,5 %) und Diuretika (63,6 %).
Die primäre Hypothese, dass die Compliance nach Umstellung von einem Ramipril-Original-Präparat nach dessen Patentauslauf auf ein Generikum signifikant abnimmt, konnte nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden für Patienten ermittelt, welche mit Ramipril-Monopräparaten, nur mit Fixkombinationen aus Ramipril mit einem Diuretikum, oder mit beidem (duale Therapie) behandelt wurden.
Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Projekte zeigen, dass die medikamentöse Therapietreue bei Patienten unter antihypertensiver Therapie in Deutschland verbesserungswürdig ist, und dass die Ermittlung der Adhärenz, Compliance und Persistenz von immenser Wichtigkeit ist. Trotz der unterschiedlichen gewählten An-sätze kongruieren die Ergebnisse sehr gut. Patienten benötigen Unterstützung in der Durchführung ihrer medikamentösen Therapie mit AHT, um gesteckte Therapieziele zu erreichen, welche dazu beitragen können, Morbidität und Mortalität zu verringern bzw. die Lebensqualität zu verbessern. Ein erster Schritt dazu ist das zielgerichtete Erkennen therapiebezogener Probleme. Da es hierfür in Deutschland bisher keine strukturierten Instrumente gibt, welche flächendeckend in den Apothekenalltag implementiert wurden, könnte das neu entwickelte und auf Machbarkeit getestete Befragungsinstrument ein Ansatz sein, die Patienten gezielt und zeitsparend nach ihren Problemen mit der Arznei-mitteleinnahme zu befragen und frühestmöglich intervenieren zu können.
Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von
Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur
weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus,
das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen
Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden
Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert:
· Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps
Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten
Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die
erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende
Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen,
dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des
Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus
und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0
und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde
deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in
die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der
temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der
bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine
Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die
beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen
bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem
Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein
entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt
direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen
Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt.
In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten
Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten
oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat
über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur,
was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al.,
Theoretischer Teil
-4-
2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats
konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels
Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase
konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex
vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des
Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats
bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur.
· Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats
Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm:
79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit
um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus
wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des
Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des
Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der
Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für
die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA
weist eine leicht verringerte Aktivität auf.
Tabelle 2.1: ...
Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung
des Parvulustats
Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen
hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region
gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von
der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b-
Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen.
Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die
energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur
Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine
thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von
Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es
eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern
in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen.
· Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats
Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats
wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin
zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten
thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A,
P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten.
Theoretischer Teil
-6-
Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch
die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die
flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt.
· Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats
Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler
Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter
Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden
Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in
Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten
wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und
fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des
Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden.
Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende
Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien
Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des
Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische
Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes
70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der
thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung
nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem
strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle
70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche
Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und
C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die
Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert
des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten
Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses
Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente
in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt.
Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu
sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der
Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die
Proteinstabilität zu bekommen.
Theoretischer Teil
-7-
Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich
aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus
(Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions-
Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats
C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante
C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende
Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC
bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses
konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive
Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer
cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für
weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität
und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend
erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.
The display of foreign polypeptides and proteins on the surface of viruses or cells provides an important tool for the engineering of biomolecules and the analysis of their interactions with binding partners. The most extensively used display platform is the coat protein of the filamentous bacteriophage (Smith, 1985). Phage display libraries have often been selected for polypeptides, e.g. single chain (sc) antibodies that bind to a protein of interest, but in vivo selection could only be demonstrated for peptides so far. An alternative display platform is the retrovirus murine leukemia virus (MLV). Here, polypeptides are displayed at the N-terminus of the viral envelope glycoprotein. Proof of principle for this platform was demonstrated for protease substrate libraries, which can be selected through coupling proteolytic activation with viral infectivity (Buchholz et al., 1998). Selection of the library CX4A on living cells resulted in viruses with more than three orders of magnitude improved spreading efficiency through tumor cells (Hartl et al., 2005). Also scAb libraries have recently been displayed and selected using retroviruses (Urban et al., 2005). The library scFvlibxMo displays the repertoire of phage display preselected sc antibodies for laminin-1 binding. The retrovirus based selection process resulted in laminin-specific sc antibodies with improved expression levels in mammalian cells.
This thesis describes the in vivo (i.e. in mouse tumor models) selection of the C-X4-A and scFvlibxMo for tumor homing upon systemic delivery.
For selection of the protease substrate library C-X4-A a subcutaneous tumor was induced in SCID mice followed by three systemic injections of the library. The selection process was monitored over a period of 34 days. After the incubation period mice were sacrificed and virus load in organs and tumor determined. PCR analysis after 34 days showed that virus from the library had preferentially infected the tumor. Sequence analysis showed the selection of protease substrates with the most prominent one with a frequency of over 65%. The four most prominent protease substrate variants where reconstituted into the original viral backbone for further investigation (C-SK-A, C-HI-A, C-HM-A and C-HS-A). Interestingly, these viruses exhibited a reduced spreading capacity in vitro on HT1080 cells as compared to the C-AK-A virus, which had previously been selected on HT1080 cells. When assayed for tumor homing, however, viruses C-HI-A and C-HS-A had clearly improved in comparison to C-AK-A. Tumor tissue had been infected at rates of over 55% while virus load of extratumoral organs was very low (infection rates <0.7 for C-HS-A and <0.02 for C-HI-A). Tumor targeting capacity had thus been improved over 10-fold by the in vivo selection of the C-X4-A library.
The experimental set up for the in vivo selection of the scFvlibxMo library was performed according to that of the C-X4-A library. Fingerprint analysis of the selected viruses that infected tumor tissue resulted in the identification of seven antibody variants showing unique CDR3 sequences. Two prominent clones (M49T-A and M49T-B) were cloned back into the MoMLV genome for further analysis of the reconstituted viruses. While variant B bound laminin-1 efficiently, variant A was unable to do so, although it was selected at highest frequency (76%). Both reconstituted viruses were equally well infectious and spread through HT1080rec1 cells at a similar efficiency as MoMLV. In an in vivo competition experiment the selected viruses clearly out-competed a laminin-1 binding reference virus L36xMo for tumor homing. To understand the molecular driving forces behind the in vivo selection process the epitope of the selected scFv M49T-A was identified using a phage peptide library approach. In silico analysis led to the identification of a small group of possible antigens, including tenascin, fibronectin and collagen.
The data described in this thesis demonstrate that the retrovirus display platform is capable of allowing the in vivo selection of protease substrates and scFvs. Notably, the replication competence of the system introduced an additional level of complexity to the library. The performed in vivo selections significantly enhanced tumor tropism. Selective infection of tumor cells combined with transfer of anti-tumoral genes is an attractive strategy for cancer therapy being in focus of current research. The viruses selected in this thesis build prime candidates for targeted retrovirus based tumor therapy.
Drug toxicity and viral resistance limit long-term efficacy of antiviral drug treatment for HIV
infection. Thus, alternative therapies need to be explored. Previously, group of “Prof. von Laer”
tested the infusion of T lymphocytes transduced with a retroviral vector (M87o) that expresses an
HIV entry inhibitory peptide (maC46). Gene-modified autologous T cells were infused into 10
HIV-infected patients with advanced disease and multidrug resistant virus during antiretroviral
combination therapy. T cell infusions were tolerated well with no severe side effects. A
significant increase of CD4 counts was observed post infusion. At the end of the one-year
follow-up, the CD4 counts of all patients were still around or above baseline. Gene-modified
cells could be detected in peripheral blood, lymph nodes and bone marrow throughout the oneyear
follow-up, whereby marking levels correlated with the cell dose. No significant changes of
viral load were observed during the first four months. Four of the seven patients that changed
their antiviral drug regimen thereafter responded with a significant decline in plasma viral load.
In conclusion, the transfer of gene-modified cells was safe, led to sustained levels of gene
marking and may improve immune competence in HIV-infected patients with advanced disease
and multidrug resistant virus. However, the low level of gene marking and the lack of substantial
long-term in vivo accumulation of gene-protected cells observed in this trial clearly demonstrate
the requirement for new vectors with new strategy.
In this thesis self‐inactivating lentiviral vectors harboring internal promoters and RNA elements
were therefore evaluated for their potential use in a clinical gene‐therapy trial. The results from
this work provide the basis for the selection of a suitable candidate vector for extensive
preclinical testing. Apart from being capable of transducing non‐dividing cells, lentiviral vectors
incorporate a number of additional features that are of potential value for gene therapeutic
applications. These include a larger packaging capacity, higher titers than γ‐retroviral vectors
and, most importantly, a reduced risk of deregulating cellular genes due to its natural integration
profile. The use of internal promoters to drive expression of the therapeutic transgene maC46
should further improve the safety profile of these new‐generation vectors, while an additional
artificial splice acceptor (SA) into the 5‟UTR of the transgene over all elevate transgene
expression. The rationale for this is that hematopoietic stem and progenitor cells will be
Summary
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protected from enhancer‐mediated transactivation effects and also from potential side effects due
to the aberrant expression of maC46 while at the same time the full clinical benefit for the
patients is maintained.
In order to find a suitable candidate for preclinical studies, two candidate therapeutic vectors
harboring different regulatory elements were selected based on results from pilot experiments.
The internal promoters used to drive expression of codon optimized maC46 were the PGK
promoter and MPSV promoter. This work focuses on the transgene expression levels in
lymphoid cells and antiviral activity. The issues of long term expression, propensity to
methylation mediated silencing of the promoters, and genotoxicity were also touched. In a first
step the performance of different vectors was evaluated in the human T cell lines. Based on
promising data from ex vivo human peripheral blood mononuclear cells, the vector carrying the
MPSV promoter along with intron were selected for in vivo transplantation experiments.
In summary, the ex vivo data suggested the long term survival of lentiviral gene modified cells,
along with maintained expression of introduced genes. It was observed that the expression of
these constructs depends strongly on the activation and differentiation status of the targeted T
cells. This regulation was not linked to any specific promotor. In vivo study shows that maC46
can be introduced into murine multiple hematopoietic lineages via lentiviral vector and expressed
at high levels in their mulilineage progeny, without altering the hematopoiesis. There was no
sign of any kind of hematopoietic or lymphoid malignancies. Although gene-modified
lymphocytes persisted in-vivo, the downregulation of transgene expression was consistent with
the ex-vivo observation. In contrast to that the T cells transplanted group showed delayed
engraftment of donor cells and there was no expression of C46 in blood and lymphatic organs. .
In conclusion, when considering HIV gene therapy focusing CD4+ T cells, potential problems of
T cell activation status as related to the desired clinical effect must be addressed. These results
might open the way for a gene therapy targeting mainly or exclusively activated T cells and
could be exploited for immunostimulatory as well as suppressive approaches.
Die vorliegende Studie hat sich die Untersuchung der Auswirkung einer Entnahme
des Fixateur internes nach thorakolumbalen Wirbelkörperfrakturen zur
Aufgabe gemacht.
Dazu wurden 87 Patienten mit einer operativ versorgten thorakolumbalen Wirbelkörperfraktur,
die mindestens 18 Monate zurücklag, untersucht. Die Patienten
wurden entweder rein dorsal mittels Fixateur interne oder kombiniert dorsoventral
versorgt. Unter den kombiniert operierten Patienten befinden sich Patienten,
deren Wirbelkörperfraktur entweder mit einem Knochenspan oder mit
einem Knochenspan in Kombination mit einem ventralen winkelstabilen Plattensystem,
oder mittels Cage behandelt wurde. Die Patienten wurden körperlich
untersucht und aktuelle Computertomogramme wurden ausgewertet. Die Lebensqualität
wurde außerdem mit Hilfe vier international anerkannter Scores
(SF-36, VAS-Wirbelsäulenscore, Oswestry, LBOS) evaluiert. Weitere von uns
erstellte Fragebögen analysierte die Spanentnahme- sowie die Metallentfernungsmorbidität.
Anschließend führten wir eine körperliche Untersuchung, die
unter anderem die Messung des Finger-Boden-Abstands, das Schober- und
Ott-Zeichen, das sensible und motorische Defizit sowie das Bewegungsausmaß
der Patienten umfasste, durch.
Bei der Analyse der radiologischen Daten zeigte sich insgesamt nach der Metallentfernung
eine Zunahme des Korrekturverlustes in Keilwinkel (von 9,5° auf
10,2°) und Grund- Deckplattenwinkel (von 9,8° auf 1 2,7°). Allerdings konnten
keine Zusammenhänge dieser statistisch nicht signifikanten Daten mit der Lebensqualität
oder der körperlichen Untersuchung ermittelt werden.
Bei der Betrachtung der subjektiven Lebensqualität zeigte sich in allen Fragebögen
eine bessere Selbsteinschätzung nach der Metallentfernung. Retrospektiv
würden 71,8% der Patienten mit Metallentfernung diese aufgrund der gesteigerten
Lebensqualität erneut durchführen lassen.
Zusammenfassung
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Auch die Beweglichkeit der Patienten in den hier durchgeführten Untersuchungen
konnte durch die Metallentfernung gesteigert werden.
Aufgrund der vorliegenden Daten gehen wir von einer Verbesserung der Lebensqualität
des Patienten nach der Entfernung des Fixateur internes aus. Diese
sollte demnach durchgeführt werden, sobald von einer sicheren Heilung der
Fraktur ausgegangen und das Risiko für übermäßige Korrekturverluste als minimal
eingeschätzt werden kann.
Wie lange dieser Heilungsverlauf benötigt und wie die in weiteren Studien mit
noch größerer Patientenzahl untersucht werden.
Bei ventraler Instrumentierung mit Entfernung von Bandscheiben kann nach
Entfernung des Fixateur interne die Beweglichkeit nicht wieder hergestellt werden.
Mit dieser dauerhaften Steifigkeit gehen sekundäre Schäden der angrenzenden
Bandscheiben einher. Um diese zu reduzieren wurde im Rahmen der
Studie der Einsatz von federbaren Cages angedacht, welche die Funktion der
extrahierten Bandscheiben ersetzen sollen. Die Praktikabilität sowie deren Wirkung
sollte in nachfolgenden Studien überprüft werden.
In der vorliegenden Studie „Einflussfaktoren auf das klinische Outcome von thorakolumalen Frakturen wurden 87 Patienten mit einer operativ versorgten thorakolumbalen Wirbelkörperfraktur, die mindestens 18 Monate zurücklag, untersucht. Die Patienten wurden entweder rein dorsal mittels Fixateur interne oder kombiniert dorsoventral versorgt. Unter den kombiniert operierten Patienten befinden ich Patienten, deren Wirbelkörperfraktur entweder mit einem Knochenspan oder mit einem Knochenspan in Kombination mit einem ventralen winkelstabilen Plattensystem oder mittels Titancage behandelt wurden. Die Patienten wurden körperlich und radiologisch mittels CT untersucht sowie ihre Lebensqualität mit Hilfe vier international anerkannter Scores (SF-36, VASWirbelsäulenscore, Oswestry, LBOS) evaluiert. Ein weiterer Fragebogen analysierte die Spanmorbidität. Bei der Durchführung der körperlichen Untersuchung, die unter anderem die Messung des Finger-Boden-Abstands, das Schober-und Ott-Zeichen, das sensible und motorische Defizit sowie das Bewegungsausmaß der Patienten umfasste, erhielten wir ebenfalls keinen Unterschied unterhalb der Gruppen. Zur radiologischen Analyse kann man sagen, dass der Korrekturverlust im Laufe der Zeit zunimmt, so dass zum Zeitpunkt unserer Nachuntersuchung Kyphosewerte wie zum Zeitpunkt unmittelbar nach dem Trauma erreicht werden. Keine Operationsmethode konnte einen Korrekturverlust verhindern. Der Korrekturverlust lag bei den Gruppen zwischen 5,5 und 8,3°. Bei der Cage-Gruppe ohne Metallentfernung betrug die Sinterungsrate 60%, mit Metallentfernung 85%. Kaudales Einbrechen war häufiger zu beobachten. Bei den Patienten, bei denen ein Knochenspan verwendet wurde, konnte oft eine unzureichende Fusion des Implantats (Span-Gruppe: 44,4%, MACS-Gruppe: 33,3%) festgestellt werden. Alle vier Quality of Life-Scores zeigten keinen Vorteil für eine Operationsmethode. Die Spanentnahmemorbidität stellte ein häufiges Problem für die betroffenen Patienten an. Parästhesien bestanden bei 71%, deren Stärke im Durchschnitt mit 5,8 auf einer Analogskala von 0-10 beziffert wurde. Schmerzen an der Spanentnahmestelle gaben 75% der Patienten an. Die Stärke betrug durchschnittlich 5,8. 52% der Patienten beschreiben die Zusammenfassung Spanentnahmestelle als belastendste Operationsstelle zum Zeitpunkt der Nachuntersuchung.
Wir führten ebenfalls eine Analyse der Frakturart der Patienten durch. Die Patienten wurden je nach Magerl-Klassifikation in die Gruppen A1-2, A 3, B-C eingeteilt. es konnten keine Unterschiede zwischen den Gruppen bezüglich der Lebensqualität oder des Korrekturverlusts festgestellt werden. So kommen wir zu dem Schluss, dass weder die Schwere des Traumas noch die Operationsmethode alleine einen signifikanten Einfluss auf das spätere Outcome haben. Die klinische Indikationsstellung zur Operations des Verfahrens ist daher nicht auf diese einzelnen Faktoren zu reduzieren. Hier spielen zahlreiche weitere Faktoren eine schwer fassbare Rolle. Hinsichtlich der Lebensqualität, des radiologischen Outcomes und der körperlichen Untersuchung konnte keine Versorgungsstrategie favorisiert werden. Angesichts des Problems der mangelnden Fusion der Knochenspäne und der häufig auftretenden Spanmorbidität, halten wir es für sinnvoll in Zukunft auf die Verwendung von Knochenspänen zu verzichten. Man würde dann bei der Wahl des operativen Verfahrens zwischen einem rein dorsalen oder einem kombinierten Verfahren mittels Titancage entscheiden.