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In Vorarbeiten wurde gezeigt, dass der Kaliumkanal Slack an der Verarbeitung neuropathischer Schmerzen funktionell beteiligt ist und dass das klassische Neuroleptikum Loxapin Slack-abhängig neuropathisches Schmerzverhalten im Mausmodell lindert (Lu et al. 2015).
Ausgehend von Loxapin als Leitstruktur wurden in der vorliegenden Arbeit im FluxOR™ Kaliumkanal-Assay an Slack-transfizierten HEK-Zellen insgesamt 68 neue Loxapin-Derivate gescreent. Hierbei wurden 23 Substanzen mit Slack-aktivierenden Eigenschaften identifiziert, von denen VHP93, VH408 und VH425 weiter in vivo untersucht wurden. Dabei zeigten Mäuse nach systemischer Gabe von VHP93 ein reduziertes Verhalten in einem Modell für neuropathische Schmerzen. Dem gegenüber wurde durch VH408 das Verhalten im neuropathischen Schmerzmodell nicht beeinflusst.
Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch eine Slack-Aktivierung nicht nur neuropathisches Schmerzverhalten gehemmt wird, sondern auch die Kratzreaktionen im Chloroquin-Modell des Histamin-unabhängigen Juckreizes reduziert werden können.
Neben Slack wurde in dieser Arbeit auch die Gewebsexpression und funktionelle Bedeutung des eng mit Slack verwandten Kaliumkanals Slick charakterisiert. Expressionsanalysen ergaben, dass Slick überwiegend in dünn myelinisierten A-delta-Fasern und inhibitorischen Interneuronen im Dorsalhorn des Rückenmarks lokalisiert ist. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten, dass Slick-Knockout-Mäuse ein erhöhtes Schmerzverhalten nach thermischer Stimulation aufwiesen. Außerdem wurde bei Slick-Knockout-Mäusen in der späten Phase des Capsaicin- und Formalin-Tests ein signifikant erhöhtes Leckverhalten verzeichnet. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern somit Hinweise auf eine funktionelle Beteiligung von Slick bei der Detektion von Hitzeschmerzen und bei der TRPV1- und TRPA1-vermittelten Schmerzantwort. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass Slick vorrangig an der Verarbeitung thermischer und chemischer Noxen beteiligt ist und dabei eine antinozizeptive Funktion ausübt.
Damit in der Schule die Vermittlung eines adäquaten Energieverständnisses gelingen kann, benötigt es eine Lehrkräfteausbildung, die dessen Herausforderungen in den Blick nimmt und die angehenden (Chemie-) Lehrerinnen und Lehrer aus fachwissenschaftlicher und didaktischer Perspektive vorbereitet. Denn in die Unterrichtsvorbereitung fließen neben bildungspolitischen und curricularen Vorgaben auch die Vorstellungen und Überzeugungen der Lehrkräfte mit ein. Zu den Herausforderungen, mit denen Lernende wie Lehrende konfrontiert sind, zählen die verschiedenen mentalen Repräsentationen zum Wort Energie aus Alltag und Naturwissenschaft, die zahlreichen chemischen Fachkontexte, in denen Energie bzw. Energiephänomene eine Rolle spielen, die unterschiedlichen Wissensnetze, die mit dem Begriff in den verschiedenen Naturwissenschaften verknüpft sind und der Einfluss der Fach- bzw. Alltagssprache.
Die (angehenden) Lehrkräfte fühlen sich auf diese Aufgabe oftmals fachlich nicht ausreichend vorbereitet. Um die Lehrkräfteausbildung in ihrem ersten Ausbildungsabschnitt auf die genannten Herausforderungen anzupassen und Lehrformate zu erweitern, benötigt es umfangreiche Kenntnisse über die mentalen Repräsentationen der Studierenden zur Energie sowie die damit verbundenen alternativen Konzepte zu schulrelevanten und lehrplanorientierten Themenschwerpunkten und die sprachlichen Besonderheiten. Die Vielschichtigkeit des Begriffs Energie erfordert eine ganzheitliche Betrachtung aller Aspekte, die es so bislang nicht gibt.
Aus diesem Grund ist es Ziel dieser Studie, die mentalen Repräsentationen der Studierenden, wie auch deren alternative Konzepte zu ausgewählten energiebezogenen Fachbegriffen aus den Bereichen chemische Bindungen, Thermodynamik und chemische Reaktionen zu erheben, in einen gemeinsamen fachlichen und sprachlichen Kontext zu setzen und daraus Rückschlüsse auf das Energieverständnis zu ziehen.
Im Sinne des Modells der didaktischen Rekonstruktion wird eine fachliche Klärung zum Untersuchungsgegenstand Energie durchgeführt. Für die Erhebung der empirischen Daten findet ein Rückgriff auf halbstandardisierte Leitfadeninterviews statt. Zielgruppe sind angehende Chemielehrkräfte, die mindestens im 5. Fachsemester Chemie für das Lehramt an Gymnasien studierten. Die Auswertung der Interviews erfolgt unter Rückgriff auf die qualitative Inhaltsanalyse nach Mayring und wird mit quantifizierenden Elementen trianguliert.
Die Studie zeigt die Erklärungsvielfalt des Begriffs Energie auf, denen sich die Studierenden bedienen. Dabei werden vor allem Beispiele einzelner Energiephänomene oder Energieformen herangezogen. In den verschiedenen Fachkontexten konnten diverse alternative Konzepte detektiert werden. Darüber hinaus konnten übergreifende Herausforderungen detektiert werden. Erkennen die Studierenden Widersprüche in ihrem Energieverständnis, wird Energie als abstrakt und schwer fassbar beschrieben. Zudem wird eine anthropozentrische Sicht eingenommen. Die angehenden Lehrkräfte neigen zu einer starken Kompartmentalisierung und begründen Wissenslücken mit der Zugehörigkeit zu anderen Fachwissenschaften. Eine weitere wichtige Erkenntnis aus der Studie ist, dass in den Fachwissenschaftlichen Veranstaltung die qualitativen Diskussionen angeregt werden müssen. Die zukünftigen Lehrerinnen und Lehrer bewegen sich in einem Spannungsverhältnis zwischen Fachwissenschaft und Didaktik und sind sich dessen sehr deutlich bewusst, indem sie bei Begriffsdefinitionen und Erklärungen die Anschaulichkeit der Exaktheit vorziehen. Es besteht die Notwendigkeit, Fachbegriffe in einem größeren Zusammenhang zu erläutern und die Studierenden zur Kommunikation darüber anzuregen.
Die vorliegende Dissertationsarbeit behandelt eine umfangreiche Studie des nukleären Rezeptors (NR) TLX (engl. tailless homolog, TLX). Als ligandenaktivierbarer Transkriptionsfaktor ist TLX in Differenzierungs- und Proliferationsprozessen involviert und übernimmt somit eine tragende regulatorische Rolle in der Neurogenese von neuronalen Stammzellen87,88. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass eine fehlgesteuerte TLX-Expression mit gravierenden kognitiven, visuellen und neurodegenerativen sowie tumorigenen Erkrankungen assoziiert ist, sodass TLX ein vielversprechendes Wirkstofftarget mit hohem therapeutischem Potential darstellt94,95,99,100 105. Die pharmakologische Validierung von TLX als neues Wirkstofftarget befindet sich allerdings aufgrund limitierter Verfügbarkeit von validierten und potenten synthetischen und natürlichen kleinen organischen Molekülen in einer frühen Phase. Daher ist das Interesse sehr groß neuartige und wünschenswerterweise selektive TLX-Modulatoren zu generieren109,119-121.
Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurden zu diesem Zweck mehrere Reportergenassays eingeführt, die die in vitro Aktivitätsstudie von TLX sowohl im Gal4-Hybridformat in Kombination mit Gal4-VP16 als starken Transkriptionsaktivator als auch als TLX-Volllängenprotein in HEK293T-Zellen (engl. human embryonic kidney, HEK293T) erlaubten. Zusätzlich wurde Gal4-TLX in Kombination mit VP16-RXRα untersucht, um bisherige unbekannte potentielle Heterodimer-vermittelte Effekte zu studieren. In einem primären Screeningansatz im Gal4-Format unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Wirkstofffragmentbibliothek und ausgewählter strukturähnlicher Wirkstoffe wurden mehrere Wirkstofffragmentkandidaten identifiziert (30, 34, 39, 45 und 47), die einen attraktiven Ausgangspunkt zur Darstellung von TLX-Modulatoren darstellten. Insgesamt wurden in vier Projekten vier strukturdiverse Chemotypen anhand von Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Studien anhand der Aktivität an TLX untersucht. Ausgehend von Fragment 34 beinhaltete das erste Projekt die Identifizierung und Charakterisierung von Xanthinderivaten als inverse TLX-Agonisten. Eine systematische Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Studie lieferte mehrere hochpotente Derivate, die auf das Grundgerüst von 8-Phenyltheophyllin (97) basierten. Parallel konnte Istradefyllin (116), welches aktuell zur Behandlung der Parkinson-Erkrankung in den USA und Japan Anwendung findet, als potenter inverser TLX-Agonist identifiziert werden. Mehrere orthogonale zelluläre und zellfreie Experimente klassifizierten die Xanthine als neue erste TLX-Modulatoren. Das zweite Projekt umfasste die Identifizierung und Charakterisierung des unselektiven β-Adrenorezeptorblockers Propranolol (54) ausgehend vom Wirkstofffragment 30. Durch eine vorläufige systematische Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Untersuchung der aliphatischen Aminoalkoholseitenkette von 54 konnte die sekundäre Aminogruppe als determinierendes Strukturmotiv für eine Aktivität an TLX bestimmt werden. Weitere Migrations- und Zellviabilitätsexperimente demonstrierten erste phänotypische Effekte in T98G-Glioblastomzellen seitens 54, die TLX-vermittelt sein könnten. Das dritte Projekt behandelte die Darstellung eines potenten neuartigen TLX-Agonisten mit Hilfe eines ligandenbasierten Pharmakophormodells. Das verwendete Pharmakophormodell wurde hierbei unter Verwendung des publizierten Referenzliganden ccrp2 (2) und dem identifizierten Wirkstofffragment 45 aus dem vorherigen Screeningansatz generiert. Durch eine anschließende rationale Fragmentfusion von 45 mit weiteren TLX-Agonisten aus dem Wirkstofffragmentscreening konnte der neuartige potente TLX-Agonist 137h synthetisiert werden, welcher eine verbesserte mikrosomale Stabilität im Vergleich zu 45 und 2 aufwies. Das vierte Projekt beinhaltete die Darstellung neuartiger TLX-Modulatoren mit Hilfe eines Scaffold Hopping Ansatzes. Hierbei wurden essentielle Strukturmotive aus der Xanthin-Struktur-Wirkungs-Beziehung (erstes Projekt) auf weitere Wirkstofffragmente übertragen. Die Validierung dieses Scaffold Hoppings anhand der Verbindung 156 führte anhand eines darauf folgenden kombinatorisch-chemischen Ansatzes zur Darstellung einer Substanzbibliothek (255 Amidrohprodukte). Ein Aktivitätsscreening der Amidrohprodukte deutete in den Reportergenassays auf drei aktive TLX-Modulatoren hin (582, 611 und 629), welche nachträglich gezielt synthetisiert, isoliert und erneut auf Aktivität an TLX validiert wurden. Hierbei hob sich besonders 629 hervor, welches in drei orthogonalen zellulären Reportergenassays TLX-vermittelte Effekte aufwies und zusätzlich einen Bindungseffekt an rekombinanter exprimierter TLX-Ligandenbindedomäne zeigte.
Mit dieser Arbeit konnte mit Hilfe der Einführung diverser TLX-basierter Reportergenassays zur Aktivitätsstudie von TLX mehrere strukturdiverse Liganden als potentielle tool compounds identifiziert und charakterisiert werden. Alle abgeleiteten TLX-Modulatoren können somit als wertvolle neue Startpunkte zur Derivatisierung neuartiger potenter Liganden und somit zu einem Fortschritt in der pharmakologischen Validierung von TLX als Wirkstofftarget dienen.
Im Rahmen dieser vorliegenden Thesis wurden verschiedene photosensitive Systeme anhand statischer und zeitaufgelöster optischer Spektroskopiemethoden charakterisiert. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag in der Entwicklung und Untersuchung neuer Quantenpunkt-basierter Hybridsysteme. Es war möglich die optischen Eigenschaften der Quantenpunkte über Optimierung der Syntheseschritte zu variieren und so auf geplante Projekte anzupassen.
Im Projekt „Quantenpunkte als Zwei-Photonen Antenne“ sollten die hohen Zwei-Photonen Einfangquerschnitte von Quantenpunkten ausgenutzt werden um in Kombination mit einer photolabilen Schutzgruppe, ein Uncaging im NIR-Bereich zu realisieren. Es wurden ZnSe/ZnS Partikel synthetisiert, die eine starke Emission im Bereich der Absorption der Schutzgruppe zeigen. Anhand von zeitaufgelösten transienten Absorptionsexperimenten mit einer Anregungswellenlänge bei 775 nm wurde eine Zwei-Photonen Absorption der Partikel nachgewiesen. Jedoch wurden starke Emissionsbeiträge aus Fallenzuständen und eine geringe Stabilität beobachtet. Die Synthese von CdS/ZnS Quantenpunkten lieferte stabile Partikel mit geringer trap state Emission. Diese Partikel wurden in einem Modellhybridsystem als Energiedonoren eingesetzt. Als Akzeptor wurde der Farbstoff Cumarin343 gewählt. In statischen Absorptions- und Emissionsmessungen, zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen sowie in fs-zeitaufgelösten transiente Absorptionsmessungen konnte ein ultraschneller Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung des Hybridsystems beobachtet werden. Über TPiF Messungen wurde die Zwei-Photonen Absorption der Quantenpunkte detektiert. Ein Energietransfer nach Zwei-Photonen Anregung der Quantenpunkte wurde beobachtet. Schließlich wurde ein Hybridsystem aus CdS/ZnS und der photolabilen Schutzgruppe Az-NDBF (Synthese im AK Heckel, Goethe Universität, Frankfurt a. M.) untersucht. Auch in diesem System wurde ein Energietransfer von Quantenpunkt auf die Schutzgruppe nach Ein- und Zwei-Photonen Anregung beobachtet. Anhand von TA Experimenten wurde eine Zeitkonstante von <100 ps für den Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung ermittelt. Es konnte anhand der vorgestellten Resultate gezeigt werden, dass sich Quantenpunkte, aufgrund der guten Anpassung ihrer optischen Eigenschaften generell sehr gut als Antennen für organische Verbindungen eigenen.
Des Weiteren wurde ein Hybridsystem aus CdSe/ZnS Quantenpunkten und einer Dyade (Verbindung eines DTE Photoschalters und BODIPY Derivats), entworfen und charakterisiert. Ein ultraschneller EET von BODIPY auf den geschlossenen DTE Schalter wurde in vorangegangenen Studien beobachtet. Dieser EET führte zur Löschung der BODIPY-Emission. Sobald der Photoschalter im offenen Zustand vorliegt, findet aufgrund des fehlenden spektralen Überlapps kein EET statt und es wird die BODIPY-Emission detektiert. Die Erweiterung der Dyade um einen Quantenpunkt zeigte nach Anregung des Quantenpunkts dessen Fluoreszenzlöschung. Da die Emissionsbande der Quantenpunkte im Absorptionsbereich des BODIPY Farbstoffes liegt, konnte über statische und zeitaufgelöste Experimente ein ultraschneller EET von CdS/ZnS auf den Farbstoff ermittelt werden. Dies führte zu der Erweiterung des Anregungsspektrums des BODIPY Farbstoffs. Die Kopplung der Dyade an die Quantenpunktoberfläche lieferte eine Verbindung mit dem breiten Anregungsspekrum des Quantenpunkts und der schaltbaren Fluoreszenz der Dyade.
Das Hybridsystem aus CdSe Quantenpunkten und PDI zeigte vom Verhältnis der Quantenpunkte zu gekoppelten PDI Molekülen abhängige Fluoreszenzsignale. In TA Experimenten wurde ein ultraschneller EET ermittelt. Für hohe PDI Konzentrationen wurde ein weiterer EET von höher angeregten Elektronen auf das PDI identifiziert. Neben der EET Charakterisierung konnte ein zusätzlicher Prozess innerhalb des Hybridsystems mit hoher PDI Konzentration beobachtet werden. Auf den EET von Quantenpunkt auf PDI folgt ein ET aus dem Valenzband des Quantenpunkts in das HOMO des PDI*. In vorangegangene Arbeiten zu Hybridsystemen aus CdSe/ZnS und PDI wurde kein ET beobachtet. In dem beschriebenen Projekt konnte der Einfluss einer passivierenden Schale auf die elektronischen Eigenschaften von CdSe Quantenpunkten gezeigt werden.
Im letzten Teil dieser Thesis wurde die spektroskopische Charakterisierung einer NVOC und zweier NDBF Schutzgruppen beschrieben. Es konnten anhand statischer Absorptionsmessungen eine Freisetzungsquantenausbeute für NVOC-Adenin von 1,1 % ermittelt werden. Die Charakterisierung der Schutzgruppen mit einer NDBF Grundstruktur (DMA-NDBF und Az-NDBF) ergab eine Abhängigkeit der Freisetzungs- und Fluoreszenzausbeute von der Polarität des Lösungsmittels. In polarer Umgebung reduzierten sich die Quantenausbeuten deutlich...
In dieser Arbeit konnte 1,8-Diborylnaphthalin (11) präparativ in einer Stufe und 65% Ausbeute aus dem literaturbekannten Boronsäureanhydrid 9 dargestellt werden. 11 ist das zweite bekannte, aromatisch verbrückte Derivat des Diborans B2H6. 11 kann als Startverbindung für eine Reihe strukturverwandter BNB-dotierter Phenalenderivate verwendet werden. Dazu werden zwei der vier Bor-gebundenen Protonen durch die Umsetzung mit einem Mesitylgrignard und Trimethylsilylchlorid substituiert. Die Umsetzung mit Wasser bzw. Aminen liefert BOB- bzw. BNB-Phenalene unter Freisetzung von elementarem Wasserstoff. Alle, auf diese Weise dargestellten Verbindungen, zeigen reversible Redoxeigenschaften und Photolumineszenz mit zum Teil besonders scharfen Emissionssignalen mit Halbhöhenbreiten von bis zu 31 nm. Zusätzlich wurden drei analoge Vertreter einer NBN-Phenalen Spezies dargestellt und charakterisiert. Die entgegengesetzte Dotierung äußert sich in einem grundlegend verschiedenem Redoxverhalten. Abschließend wurde die Reduktion des BNB-Phenalens 22 untersucht. Dabei gelang es das Radikal K[32] zu charakterisieren und seine Abbaureaktion in THF aufzuklären.
mRNS ist einer der wichtigsten Informationsträger in lebenden Zellen. Mit ihr wird die in der DNS gespeicherte Information zu aktiven Zellprozessen umgesetzt. Dabei finden erste regulatorische Prozesse, die den Phänotyp eines Organismus bestimmen können, bereits über Strukturelemente auf der mRNS statt. Diese, als Riboschalter bezeichneten Strukturen, können spezifisch, kleine Moleküle binden und dadurch ihre Struktur ändern. Durch diese dynamische Änderung der Struktur, in An- oder Abwesenheit des Liganden, wird reguliert, ob nachfolgende Gene vom Ribosom abgelesen werden können. Der Cd1-Riboschalter aus Clostridium Difficile ist schon während der Transkription aktiv und ein Teil des regulatorischen Netzwerkes, das bestimmt, ob das Bakterium einen mobilen oder stationären Lebensstil einnimmt. Das zentrale Signalmolekül in diesem Netzwerk ist der sekundäre Botenstoff c-di-GMP, der gleichzeitig auch der Ligand des Cd1-Riboschalters ist. In der folgenden Arbeit wurde der zeitliche und strukturelle Ablauf des Cd1 Regulationsmechanismus und die Bindung von c-di-GMP untersucht. Auch ohne einen Riboschalter in der Sequenz ist strukturierte mRNS ein interessanter Forschungsgegenstand. Wie die Covid-19 Pandemie und die Forschungen, mRNS Abschnitte als Krebsmedikamente zu gebrauchen, zeigen, gewinnt RNS immer mehr an Bedeutung für die medizinische Forschung und Anwendung. Mit dieser Motivation im Hintergrund wurden drei weitere RNS Projekte bearbeitet. Im ersten wurde ein 19F-Screening für die Erkennung von RNS bindenden Fragmenten etabliert. Im zweiten wurde ein RNS Doppelstrang untersucht, der mit Hilfe verschiedener, kovalent gebundener Spiropyrane reversibel gefaltet und entfaltet werden sollte. Im abschließenden Projekt wurden im Rahmen der COVID-19-NMR Initiative zwei Sekundärstrukturelemente der Covid-19 RNS untersucht.
Bei der Untersuchung des Cd1-Riboschalters konnten folgende Ergebnisse erzielt werden. Es wird gezeigt, dass die Bindung von c-di-GMP an das Cd1-Aptamer ein konzentrationsabhängiges Magnesiumverhältnis braucht. Dieses Verhältnis wurde ausgehend von initialen Messungen als 1/40 (RNS/Ligand) bestimmt. Spätere ITC Messungen geben aber Hinweise darauf, dass dieses Verhältnis bei niedrigen RNS Konzentrationen höher liegt und bei größeren RNS Konzentrationen niedriger. Die Bestimmung des Start- und Endpunktes der c-di-GMP Bindung wird in Unterkapitel 3.1.2 behandelt. Es wurde ermittelt, dass Cd1 bei 83 Nukleotiden eine alternative schwach Ligand bindende Konformation einnimmt, die wahrscheinlich durch eine P1 Helix bis zum Erreichen von Cd1-87 stabilisiert wird. Ab Cd1-87 bildet sich die reguläre von der Literatur vorhergesagte Bindetasche. Das Ende der c-di-GMP Bindung wird mit Cd1-148 erreicht, auch wenn hier noch Reste der Reportersignale für Bindung zu sehen sind. Diese Reste werden aber aller Wahrscheinlichkeit nach durch eine Cd1-83 entsprechende Konformation der Bindetasche erzeugt. In Kapitel 3.2 wird gezeigt, wie durch NMR Messungen die Zuordnung der Sekundärstruktur des Cd1-Riboschalters vollzogen wurde. Durch diese Messungen konnte bestätigt werden, dass in allen Längen eine P2 und P3 Helix vorhanden ist. Im Aptamer wird die Ligandbindung durch zwei Interaktionen zwischen P2 und P3 stark stabilisiert und der untere Abschnitt der P3 erst dann nicht mehr dynamisch, wenn c-di-GMP gebunden wird. Durch x-filter Experimente und Mutationen konnte nachgewiesen werden, dass C87 das basenpaarende Nukleotid an einem G des Liganden ist. Die Anwesenheit des HP1 Stamms konnte in den Längen 147, 148 und 160 nachgewiesen werden, wobei besonders der Vergleich der NOESY Spektren von Cd1-147 und Cd1-148 die Änderung der Sekundärstruktur hin zum Antiterminator zeigen. Der Verlauf der Bindungsaffinitäten wurde auch durch ITC Messungen an Cd1-83, 86, 87, 88, 135 und 146 bestätigt. Für die volle Länge (Cd1-160) des Riboschalters konnte gezeigt werden, dass der Terminatorstamm ausgeformt ist. Die erreichten Ergebnisse wurden in einem Modell zusammengefasst und der zeitliche Verlauf der Cd1 Regulation simuliert. Aus der Simulation ist zu erkennen, dass Cd1, wie erwartet, Ligand abhängig schaltet. Dabei ist der Aus-Zustand bei hoher Ligandkonzentration zu 90% populiert und der An-Zustand zu 100% bei niedriger Konzentration. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsgeschwindigkeit bei hohen Ligandkonzentrationen einen starken Einfluss auf die Regulationseffizienz des Riboschalters hat. So ist bei einer Transkriptionsgeschwindigkeit von 100 nt/s nach 1 s eine Gleichverteilung von An- und Aus-Zustand zu erkennen. Dieses Verhalten kann durch einen Stopp der Transkription an der potentiellen Pausierstelle U141-145 aufgehoben werden. Unter den Rahmenbedingungen des Modells erwiesen sich Transkriptionsgeschwindkeiten von um die 20 nt/s als optimal und bei niedrigen Ligandkonzentrationen hatte die Transkriptionsgeschwindigkeit faktisch keine Auswirkungen auf die Regulation. Ein interessantes Ergebniss der Modellierung ergab sich aus der Notwendigkeit der Verwendung einer Rate für konkurrenzlose Basenpaarschließungen. Hier konnte gezeigt werden, dass eine Rate von 400 nt/s ausreicht um einen voll funktionsfähigen Riboschalter zu beschreiben.
Beim 19F Bindungsscreenings von 101 Fragmenten, die alle ein oder mehrere 19F Atome besaßen, an Cd1-98 wurden 9 Fragmente gefunden die an Cd1-98 binden. Diese sind größtenteils planar mit Ausnahme von 2 Fragmenten bei denen die eine Hälfte des Moleküls nicht aromatisch ist. Des Weiteren besitzen alle Fragmente, außer einem, mindestens eine Aminogruppe im Molekül. Die daraus resultierende Vermutung, dass die Fragmente in die RNS interkalieren, konnte durch RNS beobachtende NMR Messungen nicht überprüft werden, da keine Signaländerung im Imino-Bereich zu erkennen war. Durch Verdrängungsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Fragmente, nicht wie c-di-GMP, die RNS Faltung homogenisieren und auch nicht in der Bindetasche gebunden werden.
Viele Studien konnten nachweisen, dass die Produktion von cGMP eine entscheidende Funktion im nozizeptiven System einnimmt. Hierbei wurde vor allem die cGMP-Produktion über lösliche Guanylatzyklasen untersucht. Welche Rolle die partikulären Guanlyatzyklasen bei der Entstehung von Schmerzen haben ist weitgehend ungeklärt. Die vorliegende Arbeit zeigte, dass die partikuläre Guanylatzyklase NPR2 stark in DRG-Neuronen exprimiert wird und dort mit cGKI-alpha sowie CRP4 colokalisiert ist. Aktiviert wird NPR2 über den Peptidliganden CNP. Hervorzuheben ist, dass CNP nicht in primär afferenten Neuronen, dafür jedoch vermehrt im Dorsalhorn des Rückenmarks gebildet wird. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten, dass SNS-Npr2-/--Mäuse ein verringertes Schmerzverhalten bei thermischer Stimulation aufwiesen. Während sie im Capsaicin-Test keinen Phänotyp zeigten, wiesen sie in Phase II des Formalin-Modells ein signifikant reduziertes Leckverhalten auf. Diese Ergebnisse liefern Hinweise für eine Beteiligung des CNP/NPR2/cGKI Signalwegs an der Detektion von Hitzeschmerz und an der TRPA1-vermittelten Schmerzantwort. Dabei scheint NPR2 eine pronozizeptive Funktion zu besitzen. CRP4 als Zielprotein scheint hingegen eine antinozizeptive Wirkung zu haben. Zudem kann die Hypothese aufgestellt werden, dass CNP über einen retrograden Transport aus dem Rückenmark die Aktivierung von NPR2 auslösen könnte. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass eine cGMP-abhängige Aktivierung durch NPR2 primär für die Detektion thermischer Reize zuständig ist, während die Literatur Hinweise darauf gibt, dass lösliche Guanylatzyklasen vor allem an inflammatorischen und neuropathischen Prozessen beteiligt sind. Daher scheinen partikuläre und lösliche Guanylatzyklasen unterschiedliche Eigenschaften im nozizeptiven System zu besitzen.
Im Rahmen dieser kumulativen Dissertation konnte eine Methode mitentwickelt werden, die die Bestimmung der absoluten Konfiguration pharmazeutischer Verbindungen aus Röntgenpulverbeugungsdaten ermöglicht. Die Methode basiert auf der Bildung von Salzen. Die notwendige Herstellung dieser Salze mit Salzbildnern bekannter Konfiguration wurde hinsichtlich einer minimalen Ansatzgröße optimiert und erlaubt ein Arbeiten mit Mengen von unter zehn Mikrogramm. Die Kristallisation konnte sogar direkt in den Kapillaren für die Aufnahme der Pulverdiagramme durchgeführt werden. Die absolute Konfiguration einiger als Testfälle gewählter pharmazeutischer Wirkstoffe konnte auf diese Art erfolgreich bestimmt werden. Dies stellt eine erfolgreiche Erweiterung bisher verfügbarer Methoden dar.
1,1,3,3-Tetraethyl-5-nitroisoindolin (TENI) und 1,1,3,3-Tetraethyl-5-nitroisoindolin-2-oxyl (TENO) sind Zwischenstufen in der Synthese von RNS-Spinlabeln für die EPR-Spektroskopie. Die Kristallstrukturen beider Verbindungen konnten aus Einkristallbeugungsdaten bestimmt werden. TENI hat einen Schmelzpunkt nahe der Raumtemperatur. TENO hat dagegen einen wesentlich höheren Schmelzpunkt, obwohl das Molekül nur ein Sauerstoffatom zusätzlich hat. Die Kristallstruktur liefert die Erklärung für dieses Phänomen: In der Kristallstruktur von TENI findet sich als stärkste intermolekulare Wechselwirkung eine einzelne schwache, sehr lange Wasserstoffbrückenbindung.
6-Amino-2-iminiumyl-4-oxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-aminiumsulfat, ein Edukt der Synthese von Leukopterin konnte als Hydrat erhalten werden. Die Kristallstruktur dieses Monohydrats konnte problemlos bestimmt werden, ebenso wie die von synthetisiertem 4-Amino-2,6-dimethylpyrimidin.
Natriumethanolat wurde nach einer 180 Jahre alten Vorschrift von Liebig synthetisiert. Wie die Röntgenpulverdiagramme zeigen, bilden sich dabei jedoch Gemische von verschiedenen Phasen. Die Kristallstruktur von reinem NaOEt konnte aus Pulverdaten bestimmt werden. Ebenfalls wurden ein Diethanolsolvat sowie zwei weitere Phasen identifiziert. Vom Diethanolsolvat NaOEt · 2 HOEt konnten Einkristalle hergestellt und die Kristallstruktur aus diesen bestimmt werden. Die Kristallstrukturen von Natrium-n-propanolat (NaOnPr), Natrium-n-butanolat (NaOnBu) und Natrium-n-amylat (NaOnAm) konnten ebenfalls aus Pulverdaten aufgeklärt werden. Sie weisen ein ähnliches Na-O-Gitter wie Natriumethanolat auf, allerdings kristallisieren sie in der Raumgruppe P 4/n m m. Die abweichende Raumgruppe des NaOEt (P -4 21 m) liegt am sterischen Anspruch der Ethylgruppe. Die längeren Alkylgruppen sind hochgradig fehlgeordnet und somit im Mittel zylinderförmig. Die Ethylgruppe dagegen hat einen weniger symmetrischen Raumbedarf. Die Solvate der Alkalialkoholate wurden mit zunehmender Länge der Alkylketten instabiler. Nichtsdestotrotz konnten drei verschiedene Solvate hergestellt werden: NaOnPr · 2 HOnPr, NaOiPr · 5 HOiPr und NaOtAm · HOtAm. Ihre Kristallstrukturen konnten aus Einkristallbeugungsdaten bestimmt werden. In diesen Strukturen zeigen sich sehr unterschiedliche Strukturmotive, die teilweise die mögliche Existenz weiterer Solvatstufen andeuten.
Die industriellen Rotpigmente Pigment Red 52 und Pigment Red 48 wurden im Labor unter verschiedenen Bedingungen synthetisiert. Dabei wurden neben den kommerziell verfügbaren Phasen einige neue Phasen identifiziert. Erstmals konnten Kristallstrukturen von P.R.52 und P.R.48 bestimmt werden. Von Pigment Red 52 konnte ein bisher unbekanntes Mononatriumsalz hergestellt werden. Von diesem Salz konnte ein DMSO-Solvat-Monohydrat kristallisiert werden. Aus erhaltenen Einkristallen konnte die Struktur bestimmt werden. Von Pigment Red 48 konnte ebenfalls ein bisher nicht literaturbekanntes Mononatriumsalz isoliert werden. Von zwei Hydratstufen dieser Verbindung konnten Einkristalle hergestellt und ihre Kristallstrukturen bestimmt werden. Eine weitere Phase wurde als Anhydrat identifiziert. Vom Di-Natriumsalz des P.R.52 sowie von seinem Calciumsalz wurden insgesamt fünf verschiedene Hydratstufen gefunden. Die Kristallstrukturen dieser Hydrate konnten aus Röntgenpulverbeugungsdaten bestimmt werden. Von einer Hydratstufe konnte ebenfalls ein Einkristall erhalten und die Struktur bestätigt werden. Eine Veröffentlichung ist in Vorbereitung.
Die Isomere des Orangepigments Perinon werden nach gemeinsamer Synthese industriell durch Überführung in „Trennsalze“ getrennt. Weder die Molekülkonstitution der Trennsalz-Ionen, noch die chemische Zusammensetzung der Feststoffe, noch deren Kristallstrukturen waren bisher bekannt. Die industrielle Form des „trans-Trennsalzes“ konnte im Labor hergestellt werden. Eine weitere Phase des trans-Perinontrennsalzes konnte hergestellt und identifiziert werden. Durch die nachfolgende Einkristallstrukturanalyse zeigte sich, dass die Trennsalze eine völlig andere Molekülkonstitution haben, als in der Literatur beschrieben war: Statt eines planaren Perinongerüsts enthält das Trennsalz ein verdrehtes Bis(benzimidazolat)naphthalindicarboxylat-tetraanion, dessen Ladung durch Kalium-Kationen kompensiert wird. Das bisher nie als Feststoff beschriebene cis-Perinontrennsalz wurde hergestellt und kristallisiert. Es konnten Einkristalle hergestellt und die Kristallstruktur aus diesen bestimmt werden. Alle Perinontrennsalze enthalten im Kristallgitter eine beträchtliche Anzahl Wasser- und Ethanolmoleküle. Durch Festkörper-NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass das Wasser-Ethanol-Netzwerk stark dynamisch ist. Bei der Hydrolyse der Trennsalze entstehen wieder die ursprünglichen, wasser- und lösungsmittelfreien Perinonpigmente.
RNA ist vor allem als Vermittler von Erbinformationen bekannt. Doch neben der Translation in Proteine ist sie auch maßgeblich an regulatorischen Prozessen in der Zelle beteiligt. So kommen in vielen Organismen Argonautenproteine vor, die zusammen mit microRNA einen Komplex bilden, der in der Lage ist, mRNA zu spalten oder auf andere Weise deren Translation zu unterdrücken. Da die Deregulierung von microRNA bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Parkinson oder Alzheimer auftritt, wurden in dieser Arbeit Alkylanzien entwickelt, die zur besseren Inhibierung von microRNA beitragen sollen.
Als Alkylierungsmittel wurden ortho-Chinonmethide verwendet, die zunächst in geschützter Form synthetisiert wurden und nach Aktivierung mit einer Nukleobase reagieren können. Für die Erkennung der miRNA-Sequenz wurden diese zu einem Konjugat mit Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) verbunden. Es wurden zwei Arten von Chinonmethid-Präkursoren hergestellt: Mit o Nitrobenzyl photolabil geschützte, die sich mit Licht der Wellenlänge 365 nm aktivieren lassen, und über ein Disulfid geschützte, die mithilfe eines Reduktionsmittels aktiviert werden. Die photolabil geschützten Derivate lassen sich damit gezielt örtlich und zeitlich aktivieren. Vom reduktiv aktivierbaren Präkursor wurden drei Derivate mit sterisch unterschiedlichen Resten am Disulfid (Benzyl-, Isopropyl- oder tert-Butyl-Rest) hergestellt, die einen Einfluss auf die Kinetik der Entschützung haben. Diese Derivate können nach Eintritt in eine Zelle durch die dort vorherrschende hohe Glutathion-Konzentration aktiviert werden, während sie extrazellulär unreaktiv sind.
Zunächst wurde die Kinetik eines photolabil geschützten Konjugats ohne RNA untersucht. Hier kommt es nach Bestrahlung zur Selbstalkylierung, bei der die Nukleobasen der PNA angegriffen werden. Bei 37 °C erfolgte dies mit einer Halbwertszeit von 0.43 h unter Annahme einer Reaktion 1. Ordnung. Die Kinetik der Alkylierung der komplementären RNA ließ sich durch zwei parallel ablaufende Reaktionen 1. Ordnung abbilden. Die Schnelle hatte eine Halbwertszeit von 0.42 h und die Langsame 11 h mit einer Ausbeute von 73 % nach 168 h. Bei Bestrahlung des Konjugats und erst anschließender Zugabe der RNA wurde ebenfalls eine Halbwertszeit von 11 h bei einer einzelnen Reaktionen 1. Ordnung erhalten. Dies lässt sich mit der Reversibilität mancher Reaktionsprodukte erklären. Die schnelle Reaktion entspricht der direkten Reaktion des Chinonmethids mit der RNA, die langsame entsteht durch Umlagerung von reversiblen Addukten.
Die Analyse der RNA-Alkylierung erfolgte mithilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bei der in Abhängigkeit der Gel-Temperatur scheinbar unterschiedliche Kinetiken gemessen wurden. Dies ist ebenfalls eine Folge der Reversibilität. Bei 57 °C kann ein Teil der Bindungen zwischen RNA und den Konjugaten brechen und es wird am Anfang der Reaktion eine geringere Ausbeute gemessen als bei 25 °C Geltemperatur. Die Ausbeute nach 168 h änderte sich jedoch nicht, da im Verlauf der Reaktion die reversiblen Addukte in irreversible umgewandelt werden.
Mit miRNA-20a als Ziel wurden mit einem 10mer Konjugat zunächst nur 13 % Ausbeute nach 72 h und mit einem 15mer Konjugat 41 % nach 75 h erreicht. Durch internen Einbau des Chinonmethid-Präkursors in die PNA, sodass es einem Adenosin der RNA gegenübersteht, konnte die Ausbeute auf 75 % nach 72 h gesteigert werden, da Adenosin bevorzugt alkyliert wird.
Bei den reduktiv aktivierbaren Chinonmethid-Präkursoren waren alle synthetisierten Konjugate in Puffer ohne Glutathion (GSH) stabil. Die Reihenfolge der Reaktionsgeschwindigkeit der Disulfidspaltung war bei 0.5 mM und 10 mM GSH: Benzyl > Isopropyl > tert-Butyl. Die Halbwertszeit bei 10 mM GSH betrug weniger als 5 min (Benzyl-Konjugat) bis 2 h (t Butyl Konjugat). Jedoch bildeten sich mit allen Konjugaten bei 10 mM GSH auch Addukte mit GSH.
Die Reaktivitätsreihenfolge blieb bei der Alkylierung von RNA erhalten. Allein das Benzyl-Konjugat erreichte bei einer GSH-Konzentration von 0.5 mM schon die gleiche Reaktionsgeschwindigkeit wie das photolabil geschützte Chinonmethid. Bei 10 mM GSH erreichten die Derivate zwar nach wenigen Stunden ihre maximale Ausbeute, diese betrug jedoch nur 23 % (tert-Butyl-Konjugat) bis 43 % (Benzyl-Konjugat), da die Chinonmethide auch durch GSH als Nukleophil abgefangen werden.
Mit einem Konjugat, das ein photolabiles Chinonmethid sowie Biotin trägt, wurde ein Fluoreszenzpulldown mit Cy5-markierter RNA durchgeführt. Hier zeigte die bestrahlte Probe eine deutlich höhere Fluoreszenz (6.8x), als eine unbestrahlte Vergleichsprobe. Bei einem Pulldown-Versuch mit miRNA-20a bzw. mit RISCs aus HeLa-Zelllysat konnte das Argonautenprotein jedoch nicht eindeutig mittels Westernblot nachgewiesen werden.
Anhand des reduktiv aktivierbaren Benzyl-Konjugats konnte gezeigt werden, dass sich das Konjugat in Zelllysat zersetzt und nur ein Teil zu Addukten mit Nukleobasen reagiert. Die Ursache wurde in der hydrolyselabilen Abgangsgruppe gesehen, sodass weitere photolabil geschützte Derivate mit Dimethylamino-, Trimethylammonium-, Pivaloylester- und Benzoylestergruppe synthetisiert wurden. Von diesen war nur das Benzoylester-Konjugat in der Lage, RNA mit 72 % Ausbeute nach 48 Stunden zu alkylieren. Zudem war es für mindestens 1 h in Zelllysat stabil.